生物体液多种类固醇激素的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种生物体液多种类固醇激素的检测方法，属于分析化学及临床检验技术领域，能够解决现有的类固醇激素检测方法检测时间长、检测效率低，检测灵敏度低的问题。通过将含有待检测物的生物体液经过预处理，检测分析，得到生物体液多种类固醇激素的检测结果；预处理包括液液萃取。本发明专利技术通过萃取去除蛋白及其他亲水性小分子杂质，降低了样本中其他杂质的干扰；采用非衍生化方法，简化操作步骤，提高重复性；且能同时测量九种类固醇激素的含量，检测结果准确、重复性和稳定性好。

【技术实现步骤摘要】
生物体液多种类固醇激素的检测方法
本专利技术涉及分析化学及临床检验
，尤其是涉及生物体液多种类固醇激素的检测方法。
技术介绍
类固醇激素是胆固醇经一系列酶催化产生的脂溶性小分子，具有维持新陈代谢、调节性功能等重要作用。类固醇激素在人体各种酶的催化下会相互代谢，不断产生或消耗，从而维持在一个动态的平衡状态。因此临床上需要准确检测每种类固醇激素的浓度，并了解其上下游产物直接的代谢关系。这能够为内分泌系统疾病、男/女性生殖系统疾病，肿瘤，生育功能等诊断提供帮助。但由于类固醇激素涉及分子种类多、结构类似、体内含量低，定量检测分析存在一定的难度。目前，临床上多用免疫分析法检测类固醇激素，可以自动化操作，检测快速、成本低，其缺点是特异性差，容易出现交叉反应，不能区分检测结构类似物，而且一次只能检测一种类固醇激素，更重要的是，类固醇激素代谢通路中部分激素没有特异的免疫反应，因此这些激素不能通过免疫分析法进行检测。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种生物体液多种类固醇激素的检测方法，能够解决现有的类固醇激素检测方法检测时间长、检测效率低，检测灵敏度低的问题。为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种生物体液多种类固醇激素的检测方法，包括以下步骤：将含有待检测物的生物体液经过预处理，检测分析，得到生物体液多种类固醇激素的检测结果；所述生物体液中含有类固醇激素；所述预处理包括液液萃取。通过液液萃取去除蛋白及其他亲水性小分子杂质，降低了生物体液中其他杂质的干扰。作为本专利技术再进一步的方案：所述液液萃取选自盐析辅助液液萃取、叔丁基甲醚萃取中的至少一种；所述盐析辅助液液萃取中盐析辅助试剂包括饱和高价磷酸盐溶液和异丙醇；其中，所述饱和高价磷酸盐溶液和异丙醇的体积比例为4:1～1:4。优选的，饱和高价磷酸盐溶液和异丙醇的体积比独立选自：4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4。具体的，将所述饱和高价磷酸盐溶液和异丙醇的混合溶液记为SALLE试剂。作为本专利技术再进一步的方案：所述液液萃取包括：将液液萃取剂加入到待萃取物中，涡旋1～3分钟；优选地，所述液液萃取包括：将液液萃取剂加入到待萃取物中，涡旋1～3分钟，离心，复溶后涡旋。具体的，液液萃取包括：将液液萃取剂加入到待萃取物中，震荡离心取上清液，氮气吹干，加入复溶液，震荡离心取上清液得待测样品。优选的，复溶剂为50％-100％的乙腈溶液。作为本专利技术再进一步的方案：所述生物体液包括血浆、血清、尿液和唾液中的至少一种；所述类固醇激素选自皮质醇、可的松、11-脱氧皮质醇、皮质酮、脱氢表雄酮、睾酮、17-羟孕酮、雄烯二酮和孕酮中的至少一种。作为本专利技术再进一步的方案：所述检测分析包括：采用同位素内标定量法进行定量分析。作为本专利技术再进一步的方案：所述待检测物中包括类固醇激素的同位素内标物；所述类固醇激素的同位素内标物选自类固醇激素的13C标记物或氘代标记物；优选的，所述类固醇激素的同位素内标选自d4-皮质醇、d8-可的松、d5-11-脱氧皮质醇、d8-皮质酮、d6-脱氢表雄酮、d3-睾酮、13C3-17-羟孕酮、d3-雄烯二酮、d9-孕酮。优选地，所述类固醇激素的同位素内标物包括d4-皮质醇、d8-可的松、d5-11-脱氧皮质醇、d8-皮质酮、d6-脱氢表雄酮、d3-睾酮、13C3-17-羟孕酮、d3-雄烯二酮、d9-孕酮中的至少一种。具体的，同位素内标工作液制备方法：用甲醇分别配制d4-皮质醇、d8-可的松、d5-11-脱氧皮质醇、d8-皮质酮、d6-脱氢表雄酮、d3-睾酮、13C3-17-羟孕酮、d3-雄烯二酮或d9-孕酮的储备液1mg/mL，用体积分数为50％～100％的甲醇溶液将上述储备液稀释为同位素内标的混合溶液，其浓度为：1ng/mL～100ng/mL。优选的，同位素内标液的加入量为：生物体液与同位素内标液体积比1～15：1。具体的，在200μL生物体液样本中加入20μL含d4-皮质醇、d8-可的松、d5-11-脱氧皮质醇、d8-皮质酮、d6-脱氢表雄酮、d3-睾酮、13C3-17-羟孕酮、d3-雄烯二酮、d9-孕酮的同位素内标工作液，加入1mLSALLE试剂或1mL叔丁基甲醚，涡旋1～3分钟、15000rpm离心5～10分钟后取上清液40℃氮气吹干，加入体积分数为50％～100％的乙腈溶液30μL～100μL进行复溶，涡旋1分钟，15000rpm离心5～10分钟后取上清液得待测样品。具体的，标准品的配制方法：用甲醇分别配制皮质醇、可的松、11-脱氧皮质醇、皮质酮、脱氢表雄酮、睾酮、17-羟孕酮、雄烯二酮和孕酮的储备液1mg/mL，用体积分数为50％～100％的甲醇溶液将上述储备液稀释为系列标准品溶液，共5个浓度点。具体的，标准品的萃取步骤为：在180μL空白基质中加入20μL系列标准品溶液，再加入20μL同位素内标工作液，加入1mLSALLE试剂或1mL叔丁基甲醚，涡旋1～3分钟、15000rpm离心5～10分钟后取上清液40℃氮气吹干，加入体积分数为50％～100％的乙腈溶液30μL～100μL进行复溶，涡旋1分钟，15000rpm离心5～10分钟后取上清液得待测样品，其中，空白基质为去除类固醇激素的空白血浆、血清、尿液或唾液。作为本专利技术再进一步的方案：采用同位素内标定量法进行定量分析包括：以标准品浓度为x轴，以标准品与内标物峰面积比为y轴绘制标准曲线。作为本专利技术再进一步的方案：所述检测分析包括：将经过预处理的待检测样品采用液相色谱串联质谱法进行检测，采用同位素内标定量法进行定量分析，得到待检测物中的类固醇激素含量；优选地，采用高效液相色谱串联质谱法进行检测。作为本专利技术再进一步的方案：液相色谱条件为：色谱柱为反向色谱柱，流动相由流动相A和流动相B按比例组成进行梯度洗脱；流动相A为体积分数为0.1％～2％的挥发性酸溶液或0.1mmol/L～2mmol/L挥发性缓冲盐溶液；流动相B为体积分数为0.02％～0.2％甲酸的甲醇；流动相的流速为0.3mL/min～0.5mL/min，柱温为35℃～45℃；所述的挥发性酸溶液为甲酸、乙酸、三氟乙酸中的至少一种；所述的挥发性缓冲盐溶液为甲酸铵、乙酸铵、氟化铵中的至少一种。优选的，流动相A独立选自体积分数为0.1％挥发性酸溶液、0.5％挥发性酸溶液、0.8％挥发性酸溶液、1％挥发性酸溶液、1.5％挥发性酸溶液、2％挥发性酸溶液。优选的，流动相A独立选自0.1mmol/L挥发性缓冲盐溶液、0.5mmol/L挥发性缓冲盐溶液、0.8mmol/L挥发性缓冲盐溶液、1mmol/L挥发性缓冲盐溶液、1.5mmol/L挥发性缓冲盐溶液、2mmol/L挥发性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物体液多种类固醇激素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n将含有待检测物的生物体液经过预处理，检测分析，得到生物体液多种类固醇激素的检测结果；/n所述生物体液中含有类固醇激素；/n所述预处理包括液液萃取。/n

【技术特征摘要】
1.一种生物体液多种类固醇激素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将含有待检测物的生物体液经过预处理，检测分析，得到生物体液多种类固醇激素的检测结果；
所述生物体液中含有类固醇激素；
所述预处理包括液液萃取。


2.根据权利要求1所述的生物体液多种类固醇激素的检测方法，其特征在于，所述液液萃取选自盐析辅助液液萃取、叔丁基甲醚萃取中的至少一种；
所述盐析辅助液液萃取中盐析辅助试剂包括饱和高价磷酸盐溶液和异丙醇；
其中，所述饱和高价磷酸盐溶液和异丙醇的体积比例为4:1～1:4。


3.根据权利要求1或2所述的生物体液多种类固醇激素的检测方法，其特征在于，所述液液萃取包括：
将液液萃取剂加入到待萃取物中，涡旋1～3分钟；
优选地，所述液液萃取包括：
将液液萃取剂加入到待萃取物中，涡旋1～3分钟，离心，复溶后涡旋。


4.根据权利要求1所述的生物体液多种类固醇激素的检测方法，其特征在于，所述生物体液包括血浆、血清、尿液和唾液中的至少一种；
所述类固醇激素选自皮质醇、可的松、11-脱氧皮质醇、皮质酮、脱氢表雄酮、睾酮、17-羟孕酮、雄烯二酮和孕酮中的至少一种。


5.根据权利要求1所述的生物体液多种类固醇激素的检测方法，其特征在于，所述检测分析包括：采用同位素内标定量法进行定量分析。


6.根据权利要求5所述的生物体液多种类固醇激素的检测方法，其特征在于，所述待检测物中包括类固醇激素的同位素内标物；
所述类固醇激素的同位素内标物选自类固醇激素的13C标记物或氘代标...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓哲，刘欣欣，刘丹，程孟春，赵楠，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21