基于可视化BPE-ECL技术检测大肠杆菌的方法技术

本发明专利技术公开了基于免疫磁珠分离的试剂盒，以及该试剂盒的应用。本发明专利技术还公开了基于可视化BPE‑ECL技术检测大肠杆菌浓度的方法。本发明专利技术内容还公开了所述的试剂盒以及检测方法在检测食品中的大肠杆菌浓度的应用。本发明专利技术建立的可视化BPE‑ECL技术检测大肠杆菌浓度的方法，可通过裸眼观察待测样品中是否存在大肠杆菌，它具有原理简单、快速（实验周期为45 min）、特异性强、检测灵敏度高（检测限为10

【技术实现步骤摘要】
基于可视化BPE-ECL技术检测大肠杆菌的方法
本专利技术属于生物传感
，具体涉及基于可视化BPE-ECL技术检测大肠杆菌的方法，尤其涉及基于可视化BPE-ECL技术检测大肠杆菌O157：H7浓度的方法。
技术介绍
食源性致病菌，指在食品的加工和流通过程中引入的病原菌，这些病原菌在食品中存活、生长代谢引起食物的变质和破坏，同时有些病原菌分泌有毒物质，直接或间接导致人患病，常见的食源性病原菌有致病性大肠杆菌(特别是出血性大肠杆菌O157：H7)、空肠弯曲菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、阪崎肠杆菌、沙门氏菌等。食源性致病菌的危害并不随着经济的发展而减少，世界范围内的食品安全事件接连发生。食源性致病菌轻则导致恶心、呕吐、发烧、腹泻等，重则出现呼吸、神经、循环系统的损伤，长期食用某些变质食品会表现致畸、致癌、致突变的作用，具有严重的潜在作用。大肠杆菌O157：H7作为食源性致病菌之一，常常在受污染的食品如奶制品，叶用蔬菜等中发现它的身影，引起了社会各界的广泛关注，因此开发一种快速、灵敏的用于检测食品中大肠杆菌O157：H7的方法显得尤为重要。目前，检测大肠杆菌O157：H7的方法十分繁多，传统的平板计数法准确但是耗费太多的人力和材料，且时间太长，酶联免疫吸附剂测定(ELISA)较快但敏感度较低，PCR准确但其操作复杂，需要技术熟练的操作人员。免疫磁分离技术(ImmunomagneticSeparation，IMS)是利用抗原抗体的特异性识别和纳米磁珠的磁响应性对目标物进行分离富集的技术。其拥有灵敏度高、特异性强、分离速度快等优点，可排除基质对于后期检测方法的影响，在食源性病原微生物的检测中得到了广泛的应用。近年来，联用双极电极和电致化学发光技术制备的传感器在生物分析(如小分子检测)和临床诊断(如肿瘤标志物检测)等领域的基础研究引发了热烈关注。BPE-ECL技术大大降低了获得和检测信号的难度，与BPE结合，ECL保留了其灵敏度高、可控性好、仪器简单、分析速度快，且可以获得与反应有关的多种信息等优点。当采用双极电极进行ECL检测时，一方面，原本在双极电极表面产生的电流信号直接转变为更易检测的光信号，而且完全摆脱了导线的束缚；另一方面，ECL所获得的光信号为发光物质发生电化学反应产生的激发态所释放，此过程与电极表面的法拉第过程直接相关，可以消除传统电化学中充放电电流以及迁移电流等一系列背景电流的干扰。已有文献报道BPE-ECL技术用于检测黄曲霉毒素，在双极电极阴极上发生抗原抗体反应，并结合HRP催化聚苯胺原位生成的原理，运用聚苯胺这一电化学活性物质可以引发ECL变化的性质，定量检测黄曲霉毒素，由于电化学反应的灵敏度极高，在检测黄曲霉毒素过程中需要严格控制其检测环境等条件，重复性很难保证。在其他报道中，BPE-ECL技术被用于检测前列腺特异抗原(PSA)，在双极电极阴极端进行金纳米离子复合材料的功能界面的组装，降低了单位样品的检测效率。双极电极还可以通过其结构将待检测物和信号分子分隔开，不仅降低了杂质引入的干扰，也为原位、活体检测提供了一种可靠的手段。但是并没有报道表明能够不借助其他化学反应直接利用菌株本身的特性联用可视化BPE-ECL技术可以对食品中的大肠杆菌进行检测。基于此，开发一种更为简便的免疫磁分离技术与可视化BPE-ECL技术联用用于定量检测食品中大肠杆菌O157：H7的方法迫在眉睫。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种基于免疫磁珠分离的试剂盒。本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种可视化BPE-ECL技术用于检测食品中大肠杆菌的方法。本专利技术最后要解决的技术问题是提供了该试剂盒以及检测方法在食品中检测大肠杆菌O157：H7的应用。本专利技术基于抗原抗体反应，免疫磁珠特异性地捕获大肠杆菌O157：H7，利用磁珠的磁响应性对IMBs-E.coliO157：H7复合物进行分离富集，将复合物滴加在双极电极阴极端，由于E.coliO157：H7的存在导致双极电极阴极端电阻抗的变化，从而引起双极电极阳极端电致化学发光体系光强变化，进而实现对待测样品中E.coliO157：H7进行定量可视化检测。技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案为：一种基于免疫磁珠分离的试剂盒，所述试剂盒包括大肠杆菌免疫磁珠、丝网印刷双极电极、电致化学发光试剂及共反应剂。其中，所述电致化学发光试剂为Ru(bpy)3Cl2·6H2O，共反应剂为TPA。其中，所述大肠杆菌免疫磁珠为E.coliO157：H7免疫磁珠。本
技术实现思路
还包括基于可视化BPE-ECL技术检测大肠杆菌的方法，所述方法是通过大肠杆菌免疫磁珠特异性识别并捕获不同浓度的大肠杆菌，孵育形成IMBs-E.coli复合物，利用免疫磁分离技术，复合物实现快速分离，双极电极施加外接恒电压，阴极端上不同浓度的大肠杆菌导致复合物电阻抗变化，从而引发阳极端ECL信号变化，联用荧光仪检测得到ECL值，从而得到E.coli浓度与ECL的标准曲线，根据ECL的标准曲线确定待测样品中E.coli的浓度。其中，作为优选，所述大肠杆菌为E.coliO157：H7。其中，作为优选，所述大肠杆菌免疫磁珠为E.coliO157：H7免疫磁珠。其中，作为优选，所述大肠杆菌的浓度为101-108CFU/mL。其中，作为优选，所述大肠杆菌免疫磁珠粒径为200～1000nm。其中，作为优选，所述大肠杆菌免疫磁珠与大肠杆菌的体积比为1∶25。其中，作为优选，所述孵育温度为20～45℃。其中，作为优选，所述恒电压为5.0～7.5V。本
技术实现思路
还包括所述的试剂盒、所述的检测方法在检测食品基质或配料或辅料或食品中大肠杆菌中的应用。其中，所述食品包括但不仅限于所述食品为牛肉、火腿肠、鸡蛋、纯牛奶、脱脂牛奶、橘子汁、苹果汁、番茄汁、蜂蜜、啤酒、醋、酱油、苹果、生菜、豆干、酱菜、干紫菜、蛋糕、面包、巧克力、干脆面、海苔或其他食品或饮料，食品基质或配(辅)料：葡萄糖、氯化钠、大豆油等均可用于其他食品中的关于E.coliO157：H7的检测。其中，上述双极电极为丝网印刷双极电极，所述丝网印刷双极电极长约3.4cm，宽约1cm，双极电极导线长约12mm。其中，作为进一步优选的，上述E.coliO157：H7的培养：(1)从-80℃冰箱取出保藏在50％(v/v)甘油中的菌种，解冻后，以1％接种量接种至10mL的LB(Luria-Bertani)液体培养基中，在37℃、160rpm恒温摇床中培养18-24h；(2)将上述得到的菌液按照相同的比例转接入10mL的LB液体培养基中，37℃，160rpm培养2.5h；(3)取1mL菌液至1.5mL离心管中，使用冷冻离心机在4℃、8000rpm，离心10min，弃上清得菌体沉淀；(4)加入1mL无菌生理盐水重悬菌体，于4℃、8000rpm，离心10min，以洗去残留的培养基，加入1mL无菌生理盐水(0.85％NaCl)重悬菌体；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于免疫磁珠分离的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括大肠杆菌免疫磁珠、丝网印刷双极电极、电致化学发光试剂及共反应剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于免疫磁珠分离的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括大肠杆菌免疫磁珠、丝网印刷双极电极、电致化学发光试剂及共反应剂。


2.根据权利要求1所述的免疫磁珠分离的试剂盒，其特征在于，所述大肠杆菌免疫磁珠为E.coliO157:H7免疫磁珠。


3.根据权利要求1所述的免疫磁珠分离的试剂盒，其特征在于，所述电致化学发光试剂为Ru(bpy)3Cl2·6H2O，共反应剂为TPA。


4.基于权利要求1~3任一项所述的试剂盒的可视化BPE-ECL技术检测大肠杆菌浓度的方法，其特征在于，所述方法是：通过大肠杆菌免疫磁珠特异性识别并捕获大肠杆菌，孵育形成IMBs-E.coli复合物，利用免疫磁分离技术，复合物实现快速分离，双极电极施加外接恒电压，阴极端上不同浓度的大肠杆菌导致复合物电阻抗变化，从而引发阳极端ECL信号变化，联用荧光仪检测得到ECL值，从而得到E.coli浓度与ECL的标准曲线，根据ECL的标准曲线确定待测样品中E.coli的浓度。


5.根据权利要求4所述的基于可视化BPE-E...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘元建，王敏惠，熊晓辉，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32