牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的制备及应用制造技术

本发明专利技术公开了牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的制备及应用。本发明专利技术提供了牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒，由牛病毒性腹泻病毒E

【技术实现步骤摘要】
牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的制备及应用
本专利技术属于生物
，涉及一种牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的制备及应用。
技术介绍
牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)为黄病毒科，瘟病毒属的成员之一，同属的成员有猪瘟病毒(Swinefevervirus，CFV)，羊边界病毒(Sheepbordervirus，SBV)。BVDV有囊膜，粒径大约50nm，基因组为单股正链RNA，全长大约12.3kb，由一个5'非翻译区(UTR)，一个3'非编码区(NCR)和一个编码约3,988个氨基酸的开放阅读框(ORF)组成，5'UTR包含一个高度保守的内部核糖体进入位点(IRES)。ORF经细胞和病毒蛋白酶加工后生成11种功能蛋白：NH2-Npro，C，Erns，E1，E2，p7，NS2-3(NS2和NS3)，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B。BVDV有三种基因型：BVDV-1(BVDV-1a～BVDV-1u)，BVDV-2(BVDV-2a～BVDV-2d)和BVDV-3(Hobi-like)，根据BVDV对细胞的致病变作用可分为致细胞病变型(Cytopathicbiotype，CP)和NCP。Erns和E2是两个囊膜糖蛋白，通常以二硫键连接的同源二聚体形式存在。Erns包含8～9个保守的半胱氨酸残基，这些残基形成分子内和分子间的二硫键，成熟的Erns中的碳水化合物含量超过50％。E2含有15～17个半胱氨酸残基，这在所有基因型中均保守，此外，E2与细胞表面受体CD46结合，介导BVDV进入宿主细胞。BVDV在世界范围内广泛流行，对全球农业构成了巨大威胁。BVDV能够感染多种动物，包括牛，猪，绵羊，山羊，鹿和骆驼科动物。BVDV感染牛后，通常会诱发牛的急性感染和持续性感染(PI)。与急性感染相关的症状包括腹泻，发烧，白细胞减少，咳嗽和鼻涕增加。当非细胞病变型(Non-cytopathicbiotype，NCP)BVDV穿过胎盘屏障感染免疫功能低下的胎儿时，即可建立PI。PI牛是传播BVDV的主要来源。在中国，根据2003-2009年至2010-2018年间的流行病学分析，奶牛中BVDV的血清阳性率为57％，病毒RNA阳性率约为27.1％。另有研究表明，罐装牛奶中病毒的RNA阳性率为43.7％，其中鉴定出BVDV-1a，1c和1m为主要流行毒株。目前，BVDV商品化的疫苗有灭活疫苗和弱毒疫苗，但是这两种类型的疫苗都有缺点。弱毒疫苗可能会引起胎儿流产，或导致PI牛产生。灭活疫苗虽然安全性高，但与弱毒疫苗相比，其诱导的细胞免疫应答能力较弱。此外，接种BVDV疫苗牛与感染BVDV牛在血清学上不能区分，这给牛场的BVDV监测带来了困难。需要付出更多的努力来探索安全有效的BVDV疫苗的选择。病毒样颗粒(Virus-LikeParticles，VLP)是由一种或多种病毒蛋白构成的非感染性病毒颗粒。VLP在组成和结构上类似于天然病毒粒子，与病毒的单个蛋白或多肽相比，VLP表面上显示出更多的重复表位，能触发更强的B细胞和T细胞介导的免疫反应。杆状病毒表达系统(Baculovirusexpressionvectorsystem，BEVS)已广泛用于VLP的生产，目前基于此表达系统已有几种许可的疫苗，例如HPV16/18疫苗(CERVARIX，GSK)和流感病毒疫苗(NanoFlu，Novavax)。杆状病毒整合外源基因的能力强，仅感染节肢动物，对哺乳动物基本上无致病性，此外，杆状病毒还具有强大的佐剂活性。昆虫细胞适合在无血清条件下悬浮培养，允许大规模生产重组蛋白。最重要的是，BEVS中表达的大多数蛋白质都经过完整的翻译后修饰，例如N-糖基化，O-糖基化或磷酸化，有助于维持重组抗原的免疫原性。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒。本专利技术提供的牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒，由牛病毒性腹泻病毒1型的Erns蛋白和E2蛋白构成的非感染性病毒颗粒。本专利技术的牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒，直径约50nm。本专利技术另一个目的是提供一种制备上述牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的方法。本专利技术提供的方法，为利用杆状病毒表达系统(BEVS)将牛病毒性腹泻病毒1型的Erns蛋白和E2蛋白组装成病毒样颗粒。上述中，所述牛病毒性腹泻病毒1型的Erns蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2第26-252位；序列2第1-20位为gp64；序列2第21-25位为Linker；所述牛病毒性腹泻病毒1型的E2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4第26-369位；序列4第1-20位为gp64；序列4第21-25位为Linker。上述方法中，所述昆虫杆状病毒表达系统包括杆状病毒表达载体、DH10Bac菌株和昆虫细胞；所述杆状病毒表达载体选自如下任一种或者至少2种的混合：AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、BactoPac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX1.1、pSYNXIVVI+、pSYNVI+wp、pSYNXIVVI-、pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、pVL945、pVL985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、pFastBac1、pFastBacHTA、pFastBacHTB、pFastBacHTC和pFastBac-Dual；所述昆虫细胞选自如下任一种：草地贪夜蛾Sf21细胞系、草地贪夜蛾Sf9细胞系、草地贪夜蛾MimicSf9细胞系、甜菜夜蛾Se301细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG1细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG4细胞系、粉纹夜蛾BTI-Tn-5B1-4细胞系、BTI-Tn-5C1细胞系、BTI-Tn-5F2细胞系、斜纹贪夜蛾ZSU-S1-1细胞系、IBL-SL1A细胞系和家蚕卵巢细胞系BmN；在本专利技术的实施例中，所述昆虫细胞为草地贪夜蛾Sf9细胞系。上述方法中，所述方法包括如下步骤：1)将带有信号肽的牛病毒性腹泻病毒Erns蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒，由牛病毒性腹泻病毒1型的E

【技术特征摘要】
1.牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒，由牛病毒性腹泻病毒1型的Erns蛋白和E2蛋白构成的非感染性病毒颗粒。


2.一种制备权利要求1所述牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的方法，为利用杆状病毒昆虫表达系统将牛病毒性腹泻病毒1型的Erns蛋白和E2蛋白组装成病毒样颗粒。


3.根据权利要求1所述的病毒样颗粒或权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述牛病毒性腹泻病毒1型的Erns蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2第26-252位；
所述牛病毒性腹泻病毒1型的E2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4第26-369位。


4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述昆虫杆状病毒表达系统包括杆状病毒表达载体、DH10Bac菌株和昆虫细胞；
所述杆状病毒表达载体选自如下任一种或者至少2种的混合：AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、BactoPac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX1.1、pSYNXIVVI+、pSYNVI+wp、pSYNXIVVI-、pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、pVL945、pVL985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、pFastBac1、...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴文学，王展慧，彭辰，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11