一种犬用犬血清去蛋白眼睛凝胶及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种犬用犬血清去蛋白眼睛凝胶及其制备方法，所述犬血清去蛋白提取物的提取方法，简单有效，可以克服牛血清提取物中存在很多牛源的蛋白、多糖、糖肽等成分的缺陷，同时不需要添加任何外源的化学试剂或者其他成分，因此不含有外源的蛋白或者杂质，而且可以有效的去除内毒素对患宠的影响，提高患宠的接受性，增强治疗效果。本发明专利技术提供的犬用眼用凝胶是专门针对患犬使用的眼用凝胶，由于其主要成分为犬血清去蛋白提取物，因此不会产生排斥性或者其他的过敏反应，提高治疗效果。

【技术实现步骤摘要】
一种犬用犬血清去蛋白眼睛凝胶及其制备方法
本专利技术生物医药
，具体地说，涉及一种犬用犬血清去蛋白眼睛凝胶及其制备方法。
技术介绍
DECB眼用凝胶最先由瑞士Solco制药研发生产，商品名素高捷疗(solcoseryl)，于欧洲市场率先上市。素高捷疗眼膏是一种凝胶状的滴眼液，呈透明状，适用于眼干燥症及结膜、角膜溃疡或损伤。该滴眼凝胶是由小牛血提取物、凝胶基质及防腐剂组成。小牛血提取物含有小分子肽、氨基酸和无机盐。该眼药能促进眼部创伤愈合，对中轻度眼干燥症患者，能起到润湿、润滑和营养的作用。素高捷疗眼用凝胶自80年代进入我国，在临床上广泛应用。宠物眼科疾病近年激增，临床眼用制剂销量一直占据宠物用药前几位，需求很大，我国尚无宠物厂家生产此类眼膏，并且受欧洲疯牛病的影响，此类产品进口困难，价格昂贵。现在常见的生产眼用凝胶的主要原料为小牛血去蛋白提取物。小牛血去蛋白提取物，是一种从小牛血中分离提取得到的小分子生物活性物质，具有组织细胞修复及增殖作用，可广泛用于各种原因造成的皮肤、角膜溃疡、褥疮、烧伤、皮肤移植、伤口糜烂的愈合。但是由于牛血清提取物中存在很多牛源的蛋白、多糖、糖肽等成分，在具体宠物的应用时，会造成宠物的过敏反应，严重的甚至会造成休克或者死亡，严重影响了上述药物在宠物治疗中的应用。而且由于牛可能携带疯牛病、口蹄疫等多种病毒，会给后续的宠物治疗带来临床应用的安全隐患。此外，现有技术中利用牛或者胎牛血液制备去蛋白提取物的方法虽然很多，但是并不适宜于宠物的治疗过程中，而且现有的小牛血去蛋白提取物中间体的生产方法基本都为化学提取法，在提取过程中或多或少的都会引入外源的蛋白或者杂质，这会更加剧宠物治疗过程中的排斥和抵触。此外，在后续的纯化步骤中主要为离心、乙醇除蛋白、酸解酶解除蛋白、超滤除大分子物质等过程。但目前公知技术中很难最大程度的去除蛋白和保留活性物质，会造成产品质量不稳定，批次之间差距较大，影响产品的疗效，难以形成模范化的治疗标准。在中国专利CN200910246717.3公开的一种小牛血去蛋白提取物组合物注射液及其制备方法，在制备过程中需要加入枸橼酸钠、胃蛋白酶酶解、枯草杆菌蛋白酶、乙醇、木糖醇和ε-聚赖氨酸。这样的方法不仅复杂，而且需要加入大量的化学物质，从而破坏了小牛血去蛋白提取物的纯净性。在中国专利CN200410013643中使小牛血去蛋白提取物溶液中的氨基酸、小肽可聚合成大分子量的肽及高分子肽，使药品产生抗原性并降低了药品的生物活性，引起临床过敏反应增加。这种方法制备的产品并不能用在目的是降低过敏反应的宠物治疗领域，而且虽然其技术难度小，易于生产，但很难将杂质，特别是蛋白完全去除，影响了产品纯度，从而危害患者健康甚至生命。在中国专利CN200610080520中公开了另一种小牛血去蛋白提取技术，利用真空旋转蒸发仪减压除乙醇、酶水解、离心、葡聚糖G15凝胶层析脱盐和DEAE-Sephadex-50凝胶层析分离，最后膜滤除并紫外线灭菌。该方法所用酶水解除蛋白条件剧烈，破坏了更多的活性物质，使得产品生物活性降低，难以实现较好的治疗效果。因此，本领域亟需一种利用简单、便捷的方法利用宠物动物的血液制备宠物动物来源的血清去蛋白提取物来代替昂贵的、含有外源杂质的牛血清，从而获得适合中国国情的宠物眼用凝胶，使之广泛的应用在宠物的治疗过程中。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提取犬血清去蛋白提取物的方法。所述方法具体为：①原料处理：将犬血清在-20℃-40℃冻融2次后，纱布进行初过滤。②离心：将初滤后的犬血清8000rpm离心20min，收集上清液。③预过滤：离心后的上清液用500KD超滤柱过滤加压过滤，得澄清滤液。④亲和过滤：利用ConA亲和柱纯化去除内毒素。⑤超滤、分装：将滤液用截留分子量为10KD的中空纤维柱超滤收集活性多肽精制液，取样测定含量和呼吸活性。⑥经检验合格，用注射用水配成所需浓度除菌过滤、分装，即为注射用犬血清去蛋白提取物。进一步的，本专利技术提供一种犬用眼睛凝胶，所述凝胶按重量计，包括：犬血清去蛋白提取物15-30％，羧甲基纤维素钠0.5％-1％，透明质酸0.1％-7％，甘油0.1％-8％，尼泊金甲酯0.1-3％、尼泊金乙酯0.1-3％、冷结胶0.1-1％、黄原胶0.1～1％，注射用水，调pH值为6.4-7.4。进一步的，本专利技术提供一种犬用眼睛凝胶的制备方法，其具体制作步骤如下：1.取1L容器，加入甘油、羧甲基纤维素钠搅拌分散均匀；2.注射用水加热后溶解尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、透明质酸、冷结胶、黄原胶；3.将步骤②与步骤①混合搅拌，待羧甲基纤维素钠完全溶解后，过滤不溶物，置密封容器内，100℃30min流通蒸汽灭菌，完成后放至室温备用；4.取犬血清去蛋白提取物，0.22um微孔过滤器除菌过滤，无菌条件下与步骤③所得溶液混合，均质搅拌均匀，无菌分装，既得。本专利技术所获得的凝胶有机溶剂残留量低(经检测，乙醇残留量≤30ppm或更低)、且凝胶强度大于或等于1000g/cm2。而且本专利技术所制备的为离子敏感即型凝胶，该制剂以溶液形态给药，在眼部生理条件下发生相变。在水溶液中，它分子中的羰基能与阳离子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+等)结合，从无规则线团结构转变为双螺旋结构，然后双螺旋结构发生逆向聚集，从而形成三维网状凝胶结构，由溶液转变为半固体凝胶，从而延长药物眼部保留时间，减少给药次数，提高治疗效果；同时减少吸收进入循环系统的药量，减轻药物不良反应。本专利技术的凝胶中，羧甲基纤维素钠表面活性高，制成凝胶滴入眼后形成一层保护膜，并且与透明质酸联用可增大表面粘性，能使所含修复成分犬血清去蛋白提取物更好的附着在眼球上，修复伤口和溃疡面。而且羟丙基甲基纤维素溶于冷水中形成一定粘度的溶液，性质与泪液的粘弹性物质(粘蛋白)接近，可作为人工泪液使用。羟丙基甲基纤维素在滴眼剂中使用，能降低滴眼剂的表面张力，增加对角膜的通透性，增加药物的吸收，提高生物利用度。甘油有润滑保湿作用，可减轻眼睑闭合摩擦患处带来的疼痛，改善眼部炎症带来的干燥，从而防止眼部继发性损伤。透明质酸钠通过促进表皮细胞的增殖和分化，以及清除氧自由基的作用，可促进受伤部位皮肤的再生，协助修复角膜问题。尼泊金甲酯、乙酯作为抑菌剂使用，其中尼泊金甲酯对各类霉菌、酵母菌、细菌有效；尼泊金乙酯对于真菌抑制作用较强，少量使用可用于治疗真菌性角膜溃疡；两者混合使用，有良好的协同和加成。本专利技术的眼用凝胶加速6个月内能持久稳定，未见新增杂质产生，安全有效、质量可控。进一步的，本专利技术提供上述凝胶在宠物治疗中的应用，所述应用为犬眼部各种病因引起的角膜、结膜的创伤、炎症及溃疡。有益效果本专利技术提供的犬血清去蛋白提取物的提取方法，简单有效，可以克服牛血清提取物中存在很多牛源的蛋白、多糖、糖肽等成分的缺陷，同时不需要添加任何外源的化学试剂或者其他成分，因此不含有外源的蛋白或者杂质，而本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取犬血清去蛋白提取物的方法，其特征在于所述方法的步骤具体为：/n①原料处理：将犬血清在-20℃-40℃冻融2次后，纱布进行初过滤。/n②离心：将初滤后的犬血清8000rpm离心20min，收集上清液。/n③预过滤：离心后的上清液用500KD超滤柱过滤加压过滤，得澄清滤液。/n④亲和过滤：利用ConA亲和柱纯化去除内毒素。/n⑤超滤、分装：将滤液用截留分子量为10KD的中空纤维柱超滤收集活性多肽精制液，取样测定含量和呼吸活性。/n⑥经检验合格，用注射用水配成所需浓度除菌过滤、分装，即为注射用犬血清去蛋白提取物。/n

【技术特征摘要】
1.一种提取犬血清去蛋白提取物的方法，其特征在于所述方法的步骤具体为：
①原料处理：将犬血清在-20℃-40℃冻融2次后，纱布进行初过滤。
②离心：将初滤后的犬血清8000rpm离心20min，收集上清液。
③预过滤：离心后的上清液用500KD超滤柱过滤加压过滤，得澄清滤液。
④亲和过滤：利用ConA亲和柱纯化去除内毒素。
⑤超滤、分装：将滤液用截留分子量为10KD的中空纤维柱超滤收集活性多肽精制液，取样测定含量和呼吸活性。
⑥经检验合格，用注射用水配成所需浓度除菌过滤、分装，即为注射用犬血清去蛋白提取物。


2.如权利要求1所述的一种提取犬血清去蛋白提取物的方法所制备获得的犬血清去蛋白提取物。


3.一种犬用眼睛凝胶，其特征在于所述犬用眼睛凝胶含有有效量的权利要求2所述的犬血清去蛋白提取物。


4.如权利要求3所述的一种犬用眼睛凝胶，其特征在于所述凝胶按重量计，包括：
犬血清去蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪志辉，石文达，王金明，刘峰达，刘方，窦月霞，苏煜智，赵彦智，刘继红，王宏伟，
申请(专利权)人：泰州博莱得利生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32