一种基于宏组学技术从复杂环境体系中获知全程氨氧化微生物相对丰度和活性的方法技术

本发明专利技术属于水土污染防治领域，具体涉及一种基于宏组学技术从复杂环境体系中获知全程氨氧化微生物相对丰度和活性的方法。本发明专利技术通过宏基因组/宏转录组测序及生物信息学处理，从环境复杂的微生物群落中提取全程氨氧化微生物基因组及转录本，明确体系中全程氨氧化微生物的相对丰度、活性和群落结构特征，构建群体代谢潜能模型的完整图景，从而确定该类微生物对氮转化过程的潜在贡献。该方法具有通量高、灵敏度高、准确率高的特点，无需对微生物进行富集、培养，具有“原位”特性，适用于大规模的采样调查研究，对特定区域硝化管理策略的优化具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种基于宏组学技术从复杂环境体系中获知全程氨氧化微生物相对丰度和活性的方法
本专利技术属于水土污染防治领域，具体涉及一种基于宏组学技术从复杂环境体系中获知全程氨氧化微生物相对丰度和活性的方法。
技术介绍
氮是维持全球生态系统物种组成和功能多样性的必需元素，氮循环是生物地球化学循环的基本过程。由于人类活动日益频繁，造成以氨氮和硝态氮为主的含氮化合物过量排放，生态系统氮负荷持续增加，极易引发区域性甚至全球性水体富营养化等环境问题。由微生物驱动的硝化、反硝化和厌氧氨氧化是维持氮素平衡的关键。其中，硝化作用指微生物在氧气存在的条件下将氨氮氧化为亚硝氮继而氧化为硝态氮的过程，其在全球陆地和海洋中贡献的氮转化量高于反硝化和厌氧氨氧化，被认为是生物脱氮的中心环节。在过去的120年里，传统理论认为硝化作用由两大类群体—氨氧化细菌/古菌和亚硝酸盐氧化细菌合作完成。2015年末，该传统认知被彻底颠覆：欧洲研究团队成功富集并分离出具有一步式硝化能力的细菌，称作全程氨氧化微生物，可将氨氮彻底氧化为硝态氮，完成氨氧化细菌/古菌和亚硝酸盐氧化细菌合作才能完成的硝化过程。全程氨氧化微生物隶属于硝化螺旋菌属，可分为A、B两分支，它的发现是地球氮循环理论发展史上具有革命性意义的突破。鉴于硝化作用与气候变化、环境污染、工程利用等息息相关，因此有必要评估全程氨氧化微生物这一新发现类群在各生态系统中的作用，明确其生物学、生态学和生理学特性。通常用于评估的方法有微宇宙培养法和基于PCR技术的分子生物方法。微宇宙培养法具有较长的培养周期和复杂的培养条件，该方法不具有“原位”特性，难以利用于大规模的采样研究；基于PCR技术的分子生物方法受制于扩增引物的特异性，仅能针对少数基因开展研究，难以全面客观地反映全程氨氧化微生物的作用，此外，基于PCR技术的分子生物方法在区分全程氨氧化微生物与传统硝化螺旋菌之间的生态位方面亦具有较大的局限性。硕士学位论文“长江河口沉积物全程氨氧化微生物的富集及多样性分析”(余晨笛，华东师范大学，2018)对长江河口潮滩沉积物硝化菌群进行富集培养。采用宏基因组和宏转录组技术，分析潮滩富集物的菌群结构以及硝化过程主要功能基因amoA/B/C、hao、nxrA/B的丰度，多样性和基因表达模式。但尚未见有报道基于宏基因组学技术从复杂环境体系中获知全程氨氧化微生物相对丰度和活性的方法。此方法在水土污染防治领域仍属空白。
技术实现思路
有鉴于此，为了克服传统方法的瓶颈，本专利技术提供一种基于宏组学技术从复杂环境体系中获知全程氨氧化微生物相对丰度和活性的方法，用于定性和定量评估全程氨氧化微生物在各类生态系统中的作用。本专利技术通过整合宏基因组/宏转录组测序及生物信息学处理，从复杂微生物群落中提取全程氨氧化微生物的基因组及转录本，明确环境中全程氨氧化微生物的相对丰度、活性和群落结构，构建群体代谢潜能模型的完整图景，从而确定该类微生物对氮转化过程的潜在贡献。该方法可以全面评估全程氨氧化微生物在各类生态系统中的作用，对于特定区域硝化管理策略的优化具有重要意义。本专利技术采用如下的技术方案：一种基于宏组学技术从复杂环境体系中获知全程氨氧化微生物相对丰度和活性的方法，所述方法包括步骤：(1)获取环境样本宏基因组DNA优化短序列和宏转录组非核糖体RNA优化短序列；(2)采用软件对所述宏基因组DNA优化短序列进行拼接，得到宏基因组DNA长序列；(3)采用软件对所述宏基因组DNA长序列进行分箱组装，依据完整度≥70％和鸟嘌呤、胞嘧啶所占比率(G+C含量)介于54～60％之间两项标准，筛选组装基因组metagenome-assembledgenomes(MAGs)；(4)采用软件对所述宏基因组DNA长序列进行功能基因预测，基于权威非冗余蛋白数据库对功能基因进行物种分类水平鉴定，当所述宏基因组DNA长序列中有50％以上的功能基因隶属于全程氨氧化微生物，则将其定义为潜在全程氨氧化微生物DNA长序列；(5)采用软件对所述潜在全程氨氧化微生物DNA长序列进行分箱组装，依据完整度≥70％筛选组装基因组MAGs；(6)采用软件对步骤(3)和(5)所述组装基因组MAGs进行手动检查和调整，保留完整度≥70％且污染率≤10％的高质量非冗余组装基因组MAGs；(7)采用软件对所述高质量非冗余组装基因组MAGs进行功能基因预测和系统发育分析，基于权威功能数据库对所述高质量非冗余组装基因组MAGs的氨氧化和亚硝酸盐氧化代谢通路关键功能基因进行识别，筛选高质量全程氨氧化微生物组装基因组MAGs；(8)采用软件对所述高质量全程氨氧化微生物组装基因组MAGs的DNA长序列进行顺序调整和重新定向，同时填补所述高质量全程氨氧化微生物组装基因组MAGs的DNA长序列之间的缺口；(9)构建硝化螺旋菌属全基因组序列集，采用软件对硝化螺旋菌属全基因组间平均核苷酸相似度进行计算，识别新物种；(10)构建非冗余氨单加氧酶A亚基(ammoniamonooxygenasesubunitA,amoA)和联氨合成酶A亚基(hydrazinesynthasesubunitA,hzsA)氨基酸序列集、硝化螺旋菌属全基因组精英保守基因序列集、硝化螺旋菌属全基因组功能基因序列集；(11)采用软件将所述宏基因组DNA优化短序列、宏转录组非核糖体RNA优化短序列与所述非冗余amoA/hzsA氨基酸序列集分别进行同源性比对，依据相似度≥80％和对齐长度≥75个碱基计算有效amoA/hzsA短序列的数量，同时对所述有效amoA/hzsA短序列的数量进行标准化，获得全程氨氧化微生物在总氨氧化微生物中的相对丰度和活性；(12)采用软件将所述宏基因组DNA优化短序列与所述硝化螺旋菌属全基因组精英保守基因序列集进行同源性比对，依据相似度≥90％计算有效精英保守基因短序列的数量，同时对所述有效精英保守基因短序列的数量进行标准化，获得全程氨氧化微生物在硝化螺旋菌属中的相对丰度；(13)采用软件基于步骤(4)所述权威非冗余蛋白数据库，对所述宏转录组非核糖体RNA优化短序列进行物种分类水平鉴定，当所述宏转录组非核糖体RNA优化短序列隶属于硝化螺旋菌属，则将其定义为潜在硝化螺旋菌属转录组短序列；(14)采用软件将所述潜在硝化螺旋菌属转录组短序列与所述硝化螺旋菌属全基因组功能基因序列集进行同源性比对，依据相似度≥90％计算每个功能基因的有效硝化螺旋菌属转录组短序列的数量，同时对所述每个功能基因的有效硝化螺旋菌属转录组短序列的数量进行标准化，构建全程氨氧化微生物群体代谢潜能的完整表达图谱。所述步骤(1)中，环境待测样本经提取总DNA和总RNA后，利用IlluminaHiseq测序平台的paired-end150bp模式对其进行测序；待测序数据下机后，利用NGSQCToolkit软件进行质量控制，利用SortMeRNA软件进行核糖体RNA短序列的去除，获取所述宏基因组DNA优化短序列和宏转录组非核糖体RNA优化短序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于宏组学技术从复杂环境体系中获知全程氨氧化微生物相对丰度和活性的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：/n(1)获取环境样本宏基因组DNA优化短序列和宏转录组非核糖体RNA优化短序列；/n(2)采用软件对所述宏基因组DNA优化短序列进行拼接，得到宏基因组DNA长序列；/n(3)采用软件对所述宏基因组DNA长序列进行分箱组装，依据完整度≥70％、鸟嘌呤和胞嘧啶G+C含量介于54～60％之间两项标准，筛选组装基因组MAGs；/n(4)采用软件对所述宏基因组DNA长序列进行功能基因预测，基于权威非冗余蛋白数据库对功能基因进行物种分类水平鉴定，当所述宏基因组DNA长序列中有50％以上的功能基因隶属于全程氨氧化微生物，则将其定义为潜在全程氨氧化微生物DNA长序列；/n(5)采用软件对所述潜在全程氨氧化微生物DNA长序列进行分箱组装，依据完整度≥70％筛选组装基因组MAGs；/n(6)采用软件对步骤(3)和(5)所述组装基因组MAGs进行手动检查和调整，保留完整度≥70％且污染率≤10％的高质量非冗余组装基因组MAGs；/n(7)采用软件对所述高质量非冗余组装基因组MAGs进行功能基因预测和系统发育分析，基于权威功能数据库对所述高质量非冗余组装基因组MAGs的氨氧化和亚硝酸盐氧化代谢通路关键功能基因进行识别，筛选高质量全程氨氧化微生物组装基因组MAGs；/n(8)采用软件对所述高质量全程氨氧化微生物组装基因组MAGs的DNA长序列进行顺序调整和重新定向，同时填补所述高质量全程氨氧化微生物组装基因组MAGs的DNA长序列之间的缺口；/n(9)构建硝化螺旋菌属全基因组序列集，采用软件对硝化螺旋菌属全基因组间平均核苷酸相似度进行计算，识别新物种；/n(10)构建非冗余氨单加氧酶A亚基amoA和联氨合成酶A亚基hzsA氨基酸序列集、硝化螺旋菌属全基因组精英保守基因序列集及硝化螺旋菌属全基因组功能基因序列集；/n(11)采用软件将所述宏基因组DNA优化短序列、宏转录组非核糖体RNA优化短序列与所述非冗余amoA/hzsA氨基酸序列集分别进行同源性比对，依据相似度≥80％和对齐长度≥75个碱基计算有效amoA/hzsA短序列的数量，同时对所述有效amoA/hzsA短序列的数量进行标准化，获得全程氨氧化微生物在总氨氧化微生物中的相对丰度和活性；/n(12)采用软件将所述宏基因组DNA优化短序列与所述硝化螺旋菌属全基因组精英保守基因序列集进行同源性比对，依据相似度≥90％计算有效精英保守基因短序列的数量，同时对所述有效精英保守基因短序列的数量进行标准化，获得全程氨氧化微生物在硝化螺旋菌属中的相对丰度；/n(13)采用软件基于步骤(4)所述权威非冗余蛋白数据库，对所述宏转录组非核糖体RNA优化短序列进行物种分类水平鉴定，当所述宏转录组非核糖体RNA优化短序列隶属于硝化螺旋菌属，则将其定义为潜在硝化螺旋菌属转录组短序列；/n(14)采用软件将所述潜在硝化螺旋菌属转录组短序列与所述硝化螺旋菌属全基因组功能基因序列集进行同源性比对，依据相似度≥90％计算每个功能基因的有效硝化螺旋菌属转录组短序列的数量，同时对所述每个功能基因的有效硝化螺旋菌属转录组短序列的数量进行标准化，构建全程氨氧化微生物群体代谢潜能的完整表达图谱。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于宏组学技术从复杂环境体系中获知全程氨氧化微生物相对丰度和活性的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)获取环境样本宏基因组DNA优化短序列和宏转录组非核糖体RNA优化短序列；
(2)采用软件对所述宏基因组DNA优化短序列进行拼接，得到宏基因组DNA长序列；
(3)采用软件对所述宏基因组DNA长序列进行分箱组装，依据完整度≥70％、鸟嘌呤和胞嘧啶G+C含量介于54～60％之间两项标准，筛选组装基因组MAGs；
(4)采用软件对所述宏基因组DNA长序列进行功能基因预测，基于权威非冗余蛋白数据库对功能基因进行物种分类水平鉴定，当所述宏基因组DNA长序列中有50％以上的功能基因隶属于全程氨氧化微生物，则将其定义为潜在全程氨氧化微生物DNA长序列；
(5)采用软件对所述潜在全程氨氧化微生物DNA长序列进行分箱组装，依据完整度≥70％筛选组装基因组MAGs；
(6)采用软件对步骤(3)和(5)所述组装基因组MAGs进行手动检查和调整，保留完整度≥70％且污染率≤10％的高质量非冗余组装基因组MAGs；
(7)采用软件对所述高质量非冗余组装基因组MAGs进行功能基因预测和系统发育分析，基于权威功能数据库对所述高质量非冗余组装基因组MAGs的氨氧化和亚硝酸盐氧化代谢通路关键功能基因进行识别，筛选高质量全程氨氧化微生物组装基因组MAGs；
(8)采用软件对所述高质量全程氨氧化微生物组装基因组MAGs的DNA长序列进行顺序调整和重新定向，同时填补所述高质量全程氨氧化微生物组装基因组MAGs的DNA长序列之间的缺口；
(9)构建硝化螺旋菌属全基因组序列集，采用软件对硝化螺旋菌属全基因组间平均核苷酸相似度进行计算，识别新物种；
(10)构建非冗余氨单加氧酶A亚基amoA和联氨合成酶A亚基hzsA氨基酸序列集、硝化螺旋菌属全基因组精英保守基因序列集及硝化螺旋菌属全基因组功能基因序列集；
(11)采用软件将所述宏基因组DNA优化短序列、宏转录组非核糖体RNA优化短序列与所述非冗余amoA/hzsA氨基酸序列集分别进行同源性比对，依据相似度≥80％和对齐长度≥75个碱基计算有效amoA/hzsA短序列的数量，同时对所述有效amoA/hzsA短序列的数量进行标准化，获得全程氨氧化微生物在总氨氧化微生物中的相对丰度和活性；
(12)采用软件将所述宏基因组DNA优化短序列与所述硝化螺旋菌属全基因组精英保守基因序列集进行同源性比对，依据相似度≥90％计算有效精英保守基因短序列的数量，同时对所述有效精英保守基因短序列的数量进行标准化，获得全程氨氧化微生物在硝化螺旋菌属中的相对丰度；
(13)采用软件基于步骤(4)所述权威非冗余蛋白数据库，对所述宏转录组非核糖体RNA优化短序列进行物种分类水平鉴定，当所述宏转录组非核糖体RNA优化短序列隶属于硝化螺旋菌属，则将其定义为潜在硝化螺旋菌属转录组短序列；
(14)采用软件将所述潜在硝化螺旋菌属转录组短序列与所述硝化螺旋菌属全基因组功能基因序列集进行同源性比对，依据相似度≥90％计算每个功能基因的有效硝化螺旋菌属转录组短序列的数量，同时对所述每个功能基因的有效硝化螺旋菌属转录组短序列的数量进行标准化，构建全程氨氧化微生物群体代谢潜能的完整表达图谱。


2.按照权利要求1所述从复杂环境体系中获知全程氨氧化微生物在总氨氧化微生物中的相对丰度和活性的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，环境待测样本经提取总DNA和总RNA后，利用IlluminaHiseq测序平台的paired-end150bp模式对其进行测序；待测序数据下机后，利用NGSQCToolkit软件进行质量控制，利用SortMeRNA软件进行核糖体RNA短序列的去除，获取所述宏基因组DNA优化短序列和宏转录组非核糖体RNA优化短序列。


3.按照权利要求1所述从复杂环境体系中获知全程氨氧化微生物在总氨氧化微生物中的相对丰度和活性的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，利用MEGAHIT软件对所述宏基因组DNA优化短序列进行拼接，获取所述宏基因组DNA长序列。


4.按照权利要求1所述从复杂环境体系中获知全程氨氧化微生物在总氨氧化微生物中的相对丰度和活性的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，利用MaxBin2.0软件对所述宏基因组DNA长序列进行分箱组装，利用CheckM软件计算完整度和G+C含量并筛选所述组装基因组MAGs。


5.按照权利要求1所述从复杂环境体系中获知全程氨氧化微生物在总氨氧化微生物中的相对丰度和活性的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，利用MetaGeneMark软件对所述宏基因组DNA长序列进行功能基因预测，利用DIAMOND软件将所述宏基因组DNA长序列的功能基因与所述权威非冗余蛋白数据库进行同源性比对，利用MEGAN软件对所述宏基因组DNA长序列的功能基因的物种分类结果进行统计和筛选，获取所述潜在全程氨氧化微生物DNA长序列。


6.按照权利要求1所述从复杂环境体系中获知全程氨氧化微生物在总氨氧化微生物中的相对丰度和活性的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，利用MetaBAT2软件对所述潜在全程氨氧化微生物DNA长序列进行分箱组装，利用CheckM软件计算完整度并筛选所述组装基因组MAGs。

【专利技术属性】
技术研发人员：刘树枫，王海英，陈倩，王佳文，蔡鹤童，刘思彤，倪晋仁，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11