一种磁控荧光生物传感器的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种磁控荧光生物传感器的制备方法及其应用，包括如下步骤：（1）制备磁控免疫探针MB‑Ab；（2）制备脂质体包埋金簇复合物Biotin‑Liposome/AuNCs；（3）制备适配体修饰的脂质体包埋金簇复合物，即Biotin‑Liposome/AuNCs‑Aptamer信号探针；（4）利用Biotin‑Liposome/AuNCs‑Aptamer信号探针结合磁控免疫探针构建检测癌胚抗原CEA的多重信号放大磁控荧光生物传感器；检测时，先绘制传感器检测不同浓度的癌胚抗原的荧光信号工作曲线，再对临床血清样品中癌胚抗原的浓度进行检测。本发明专利技术制备方法制备的磁控荧光生物传感器抗干扰能力强，且具有高灵敏度和高选择性，可用于检测血清样品中低丰度肿瘤标志物。

【技术实现步骤摘要】
一种磁控荧光生物传感器的制备方法及其应用
本专利技术涉及生物传感器，具体是一种基于多重信号放大的磁控荧光生物传感器的制备方法及其应用。
技术介绍
肿瘤标志物又叫肿瘤标记物，它是肿瘤发生和增殖的过程当中，由肿瘤细胞合成、释放、分泌产生的，或者是因为宿主对肿瘤细胞的一种反应所产生的物质。通过肿瘤标志物的含量分析可以在临床上辅助判断是否有肿瘤，对于一些癌症的早期发现很有帮助。此外，检测肿瘤标志物还能对肿瘤病情筛查发展和治疗之后的疗效做监测。酶联免疫吸附试验（ELISA）因操作简单、快速而成为检测肿瘤标志物的一种主要方法，但检测低丰度的肿瘤标志物往往需要进行信号放大步骤。因此，构建一种可检测血清样品中低丰度肿瘤标志物的高灵敏、高选择性和抗干扰能力强的磁控荧光生物传感器，对于癌症的早期治疗及预后疗效有着重要的诊断意义。在目前已经公开检测肿瘤标志物的相关专利中，CN109900911A一种运用核壳结构纳米星检测肝癌肿瘤标志物AFP的方法，用核壳结构纳米星作为基底，通过表面增强拉曼散射原理来进行检测，尽管方法灵敏性和特异性好，但是需要对基底进行多重修饰和官能团化，方法不够简便。CN106807308A一种核壳结构的磁性纳米粒子用于提取血清中肿瘤标志物的质谱分析方法，该方法利用磁性核壳材料从血清中富集分离肿瘤标志物，并用质谱分析方法定量，虽然可以进行快速高效的检测，但是该方法特异性差，容易导致假阳性结果，且需要使用大型仪器以及进行样品前处理，操作过程繁琐复杂，仪器昂贵且庞大，无法满足现场快速检测的需求。此外，现有基于信号放大用于灵敏检测肿瘤标志物的传感分析方法中，CN111351934A一种通过空心金纳米球和纳米花瓣状二氧化锰共同修饰电极用于电化学检测肺癌肿瘤标志物的方法，空心金纳米球和纳米花瓣状二氧化锰的协同作用提高了电极比表面积并增大抗体吸附量，从而达到信号放大作用，提高了传感器的灵敏度和选择性，但需要对电极进行多重修饰，对方法的灵敏度有一定影响；CN108445213A一种纳米复合探针用于血清肿瘤标志物的高灵敏荧光定量检测方法，利用双抗夹心法将纳米复合探针固定，并将复合探针上的DNAzyme链循环利用起到荧光信号放大作用，但是该过程中直接将一抗固定于微孔板上，作用力较弱，且一抗与二抗可能产生交叉反应，对结果易造成大的干扰；CN111273025A一种基于葡萄糖氧化酶（GOD）介导的比色pH传感检测法，将磁分离、信号放大、信号转换有效结合，实现对低丰度肿瘤目标物检测，但是该法涉及到滚环扩增，需要大量辅助引物和DNA模板链，同时需要葡萄糖氧化酶的参与，价格昂贵，且酶的活性易随环境变化不稳定。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种多重信号放大的可检测血清中低丰度肿瘤标志物的磁控荧光生物传感器的制备方法，制备的生物传感器抗干扰能力强，且具有高灵敏度和选择性。本专利技术采用如下技术方案：一种基于多重信号放大的磁控荧光生物传感器的制备方法，包括如下步骤：（1）制备磁控免疫探针（MB-Ab），利用1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基丁二酰亚胺（NHS）交联作用固定anti-CEA抗体在羧基化四氧化三铁磁珠（MB）上；（2）制备脂质体包埋金簇复合物（Biotin-Liposome/AuNCs）；（3）制备适配体修饰的脂质体包埋金簇复合物，即Biotin-Liposome/AuNCs-Aptamer信号探针；（4）利用Biotin-Liposome/AuNCs-Aptamer信号探针结合磁控免疫探针构建检测癌胚抗原（CEA）的多重信号放大磁控荧光生物传感器，具体是利用MB-Ab磁控免疫探针分离富集血清样品中的癌胚抗原，链霉亲和素-生物素结合使包埋金纳米簇的脂质体聚集，将其作为癌胚抗原传感平台的多重信号放大途径，制备了检测癌胚抗原的多重信号放大的磁控荧光生物传感器；检测时，先绘制传感器检测不同浓度的癌胚抗原的荧光信号工作曲线，再对临床血清样品中癌胚抗原的浓度进行检测。步骤（1）所述制备MB-Ab磁控免疫探针，包括如下步骤：（1.1）将MB超声处理后经磁性分离，并用0.01M，pH为7.4的PBS洗涤2-3次；（1.2）洗涤后加入EDC室温下震摇10min，接着加入NHS继续震摇30min，然后磁性分离并用pH为7.4的PBS洗涤2-3次，除去多余EDC和NHS，形成活化的MB并分散于PBS中；（1.3）将anti-CEA的抗体加入到活化的MB中并于室温下震摇3h，接着磁性分离和洗涤2-3次，除去多余抗体，然后分散在1mL的2.0wt%BSA溶液中，室温下震摇1h，最后保存于4℃冰箱中；所述EDC和NHS的质量浓度比为6.72:1；所述MB和anti-CEA抗体的质量浓度比为100:1，体积比为20:1。步骤（2）所述制备脂质体包埋金簇复合物Biotin-Liposome/AuNCs，包括如下步骤：（2.1）将BSA加入烧杯中并用超纯水溶解，接着于37℃恒温水浴和强力搅拌条件下加入四氯金酸（HAuCl4）溶液，2min后再加入1MNaOH溶液，用pH试纸调至pH值为12，于37℃恒温水浴持续搅拌12h得到金纳米簇（AuNCs），将获得的AuNCs置于4℃的冰箱中保存待用；（2.2）将二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、磷脂聚乙二醇生物素（DSPE-PEG-Biotin）及胆固醇加入至50mL蒸馏瓶中，接着用3mL氯仿溶解，充分溶解后，在45℃条件下，通过旋转蒸发仪蒸去氯仿，形成一层脂质体薄膜粘附在烧瓶内壁上；（2.3）在形成的脂质体薄膜中加入AuNCs和PBS，并在45℃水浴条件下搅拌30min，最后超声5min，即获得Biotin-Liposome/AuNCs悬浮溶液，保存于4℃冰箱中。所述BSA与HAuCl4溶液的体积比为1:1；所述DSPC、DSPE-PEG-Biotin及胆固醇的质量浓度比为41.5:1:6.5；所述AuNCs和PBS的体积比为4:1。步骤（3）所述制备适配体修饰的脂质体包埋金簇复合物，即Biotin-Liposome/AuNCs-Aptamer信号探针，具体方法是：（3.1）取步骤（2）中制备的Biotin-Liposome/AuNCs悬浮溶液加入链霉亲和素（streptavidin,SA，100ng/mL），混合震摇10min；（3.2）然后加入生物素化的CEA适配体(50μM)，震摇30min，获得Biotin-Liposome/AuNCs-Aptamer信号探针，保存于4℃冰箱；所述Biotin-Liposome/AuNCs与SA和CEA适配体的体积比为3:1.5:1。步骤（4）所述利用Biotin-Liposome/AuNCs-Aptamer信号探针结合磁控免疫探针构建的CEA的多重信号放大磁控荧光生物传感器，包括如下步骤：（4.1）0.5mL离心管中加入MB-Ab和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磁控荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n（1）制备磁控免疫探针MB-Ab，利用1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐EDC与N-羟基丁二酰亚胺NHS交联作用固定anti-CEA抗体在羧基化四氧化三铁磁珠MB上；/n（2）制备脂质体包埋金簇复合物Biotin-Liposome/AuNCs；/n（3）制备适配体修饰的脂质体包埋金簇复合物，即Biotin-Liposome/AuNCs-Aptamer信号探针；/n（4）利用Biotin-Liposome/AuNCs-Aptamer信号探针结合磁控免疫探针构建检测癌胚抗原CEA的多重信号放大磁控荧光生物传感器，具体是利用MB-Ab磁控免疫探针分离富集血清样品中的癌胚抗原，链霉亲和素-生物素结合使包埋金纳米簇的脂质体聚集，将其作为癌胚抗原传感平台的多重信号放大途径，制备了检测癌胚抗原的多重信号放大的磁控荧光生物传感器；/n检测时，先绘制传感器检测不同浓度的癌胚抗原的荧光信号工作曲线，再对临床血清样品中癌胚抗原的浓度进行检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种磁控荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备磁控免疫探针MB-Ab，利用1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐EDC与N-羟基丁二酰亚胺NHS交联作用固定anti-CEA抗体在羧基化四氧化三铁磁珠MB上；
（2）制备脂质体包埋金簇复合物Biotin-Liposome/AuNCs；
（3）制备适配体修饰的脂质体包埋金簇复合物，即Biotin-Liposome/AuNCs-Aptamer信号探针；
（4）利用Biotin-Liposome/AuNCs-Aptamer信号探针结合磁控免疫探针构建检测癌胚抗原CEA的多重信号放大磁控荧光生物传感器，具体是利用MB-Ab磁控免疫探针分离富集血清样品中的癌胚抗原，链霉亲和素-生物素结合使包埋金纳米簇的脂质体聚集，将其作为癌胚抗原传感平台的多重信号放大途径，制备了检测癌胚抗原的多重信号放大的磁控荧光生物传感器；
检测时，先绘制传感器检测不同浓度的癌胚抗原的荧光信号工作曲线，再对临床血清样品中癌胚抗原的浓度进行检测。


2.根据权利要求1所述的磁控荧光生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述制备MB-Ab磁控免疫探针，包括如下步骤：
（1.1）将MB超声处理后经磁性分离，并用0.01M，pH为7.4的PBS洗涤2-3次；
（1.2）洗涤后加入EDC室温下震摇10min，接着加入NHS继续震摇30min，然后磁性分离并用pH为7.4的PBS洗涤2-3次，除去多余EDC和NHS，形成活化的MB并分散于PBS中；
（1.3）将anti-CEA抗体加入到活化的MB中并于室温下震摇3h，接着磁性分离和洗涤2-3次，除去多余抗体，然后分散在1mL的2.0wt%BSA溶液中，室温下震摇1h，最后保存于4℃冰箱中；
所述EDC和NHS的质量浓度比为6.72:1；
所述MB和anti-CEA抗体的质量浓度比为100:1，体积比为20:1。


3.根据权利要求1所述的磁控荧光生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述制备脂质体包埋金簇复合物Biotin-Liposome/AuNCs，包括如下步骤：
（2.1）将BSA加入烧杯中并用超纯水溶解，接着于37℃恒温水浴和强力搅拌条件下加入四氯金酸HAuCl4溶液，2min后再加入1MNaOH溶液，用pH试纸调至pH值为12，于37℃恒温水浴持续搅拌12h得到金纳米簇AuNCs，将获得的AuNCs置于4℃的冰箱中保存待用；
（2.2）将二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC、磷脂聚乙二醇生物素DSPE-PEG-Biotin及胆固醇加入至50mL蒸馏瓶中，接着用3mL氯仿溶解，充分溶解后，在45℃条件下，通过旋转蒸发仪蒸去氯仿，形成一层脂质体薄膜粘附在烧瓶内壁上；
（2.3）在形成的脂质体薄膜中加入AuNC...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯丽，黄娟娟，蒋高艳，林天然，赵书林，
申请(专利权)人：广西师范大学，
类型：发明
国别省市：广西;45