用于鉴定外周血循环子宫内膜细胞的方法及应用技术

本发明专利技术公开用于鉴定外周血循环子宫内膜细胞的方法及应用。本发明专利技术的鉴定方法包括在从来自受试者的外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中选择PECAM1

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定外周血循环子宫内膜细胞的方法及应用
本专利技术涉及细胞鉴定领域，具体地涉及用于鉴定外周血循环子宫内膜细胞的方法及应用。
技术介绍
子宫内膜异位症(endometriosis，EM)在生育年龄妇女中的发病率超过10％，常引起盆腔疼痛或不孕，且具有易复发、可恶变的特点，不仅会造成生理上的痛苦，也给患者的心理和社交带来障碍。目前，EM发病机制尚未明确，比较公认的是Sampson的经血逆流种植学说，但其并不能解释为什么约90％女性有经血逆流现象，而只有一部分患有EM。近年来，国内学者提出的“在位内膜决定论”，认为在位内膜的异常决定了随经血逆流的内膜碎片的命运-存活或者死亡。EM患者异常的内膜碎片随经血逆流入盆腔，完成粘附、侵袭、血管生成，最终形成EM。血行种植理论提出了另一种子宫内膜异位症碎片转移至异位的途径：EM可能是由于子宫内膜组织碎片由循环转移至异位种植形成，但具体的转移过程仍然未明。2014年有研究首次报道，EM患者中存在循环内膜细胞(CEC)，是有活性的异位病灶存在的明确而特异的证据，有助于阐释血行转移的过程，作为该学说有力的证据，有着重要的基础和临床研究价值。由于CEC与EM的临床相关性目前尚无报道，且文献报道在EM中的CEC检出率较低，仅为23.5％，这大大限制了基于CEC细胞检测EM的后续应用。申请人先前的研究表明，CEC对EM具有良好的敏感性与特异性，可更好的区别早期EM，而且不受月经周期的影响，因此可以作为诊断子宫内膜异位症的生物标志物，并且在子宫内膜异位症中CEC细胞的检出率也进一步提高到89％左右，但与此同时在健康对照及其他非子宫内膜异位症患者中也存在较高，甚至高达20％的检出率。
技术实现思路
针对现有技术中存的问题，专利技术人在进一步研究后发现先前研究的基于CEC诊断子宫内膜异位症的检测率中存在假阳性现象，而致使产生假阳性的原因主要在于在分离检测CEC细胞时存在一定数量的内皮细胞。基于此发现专利技术人进一步优化了细胞鉴定步骤，避免了内皮细胞对于检测结果的影响。至少部分地基于此完成了本专利技术。具体地，本专利技术包括以下内容。本专利技术的第一方面，提供一种用于鉴定外周血循环子宫内膜细胞的方法，其包括在从来自受试者的外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中选择PECAM1-、DAPI+、PTPRC-，同时子宫内膜标志物为阳性的细胞作为候选细胞的步骤。根据本专利技术的用于鉴定外周血中循环子宫内膜细胞的方法，优选地，进一步包括检测所述候选细胞染色体，并选择染色体异常的细胞作为外周血循环子宫内膜细胞的步骤。根据本专利技术的用于鉴定外周血中循环子宫内膜细胞的方法，优选地，通过向所述富集液相中加入能够指示选自PECAM1、PTPRC和子宫内膜标志物组成的组的蛋白的指示剂和DAPI，并根据显示结果进行所述候选细胞的选择。根据本专利技术的用于鉴定外周血中循环子宫内膜细胞的方法，优选地，所述指示剂包括抗体和与抗体偶联的可检测发光基团。根据本专利技术的用于鉴定外周血中循环子宫内膜细胞的方法，优选地，利用CEP8检测所述候选细胞的染色体是否异常。根据本专利技术的用于鉴定外周血中循环子宫内膜细胞的方法，优选地，包括以下步骤：(1)从受试者采集外周血，弃掉前2-3ml后，取6-8ml进行离心，弃上清后，加入清洗液混匀后，经密度梯度分离得到三层液体，取最上层和中间层液体混合，然后加入与磁珠结合的白细胞抗体，经磁分离后得到富集液相；(2)向所述富集液相加入含柠檬酸钠的缓冲液，然后加入染色混合液进行结合反应，离心后去上清得到细胞液，所述染色混合液包含抗PECAM1抗体、DAPI、抗PTPRC抗体、抗子宫内膜标志物抗体，且各抗体分别偶联不同的荧光基团；(3)向所述细胞液加入固定液混匀后，涂布于载玻片，干燥后加入包含CEP8探针的显色试剂进行杂交，得到检测标本；(4)在荧光显微镜下通过颜色选择PECAM1-、DAPI+、PTPRC-，同时子宫内膜标志物为阳性的细胞，进一步可选的染色体异常的细胞，将选择的细胞鉴定为外周血循环子宫内膜细胞。本专利技术的第二方面，提供一种用于诊断受试者中子宫内膜异位症的方法，其包括利用试剂在外周血中检测循环子宫内膜细胞的步骤，其中所述循环子宫内膜细胞是指PECAM1和PTPRC双阴性、DAPI阳性且ER和PR至少之一为阳性，染色体正常的细胞。根据本专利技术所述的用于诊断受试者中子宫内膜异位症的方法，优选地，所述试剂包括能够指示细胞内或其表面是否存在选自PECAM1、PTPRC和子宫内膜标志物的至少一种的指示剂和DAPI，和能够显示细胞染色体是否异常的试剂。根据本专利技术所述的用于诊断受试者中子宫内膜异位症的方法，优选地，当在每5-8ml外周血中存在大于1个循环子宫内膜细胞时，将受试者诊断为患子宫内膜异位症高风险，当在每5-8ml外周血中存在1个以下循环子宫内膜细胞时，将受试者诊断为患子宫内膜异位症低风险。根据本专利技术所述的用于诊断受试者中子宫内膜异位症的方法，优选地，所述受试者包括痛经不缓解的受试者和/或痛经进行性加重的受试者。本专利技术的方法能够在保证检出率不变的情况下大大提高循环子宫内膜细胞的鉴定准确性。附图说明图1本专利技术示例性方法得到的细胞检测结果的典型图像。图2为CEC、CVEC在EM和非EM对照中的存在情况，其中每组中左边的柱表示EM，右边的柱表示非EM。图3为CEC、CVEC在EM和非EM对照中的数量比较。图4为分层后CEC、CVEC的检出率比较，其中每组中左边的柱表示活跃型EM，中间的柱表示休眠型EM，右边的柱表示非EM对照。图5为分层后CEC、CVEC的细胞数比较。图6为CEC、CVEC和月经周期的关系。图7为CEC、CVEC和EM分期的关系。图8为小细胞和非小细胞CEC的比例。图9为二倍体和非二倍体CEC的比例。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于数量的百分数。本专利技术中，表示细胞数量或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴定外周血循环子宫内膜细胞的方法，其特征在于，包括在从来自受试者的外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中选择PECAM1

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定外周血循环子宫内膜细胞的方法，其特征在于，包括在从来自受试者的外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中选择PECAM1-、DAPI+、PTPRC-，同时子宫内膜标志物为阳性的细胞作为候选细胞的步骤。


2.根据权利要求1所述的用于鉴定外周血中循环子宫内膜细胞的方法，其特征在于，进一步包括检测所述候选细胞染色体是否异常的步骤。


3.根据权利要求1所述的用于鉴定外周血中循环子宫内膜细胞的方法，其特征在于，通过向所述富集液相中加入能够指示选自PECAM1、PTPRC和子宫内膜标志物组成的组的蛋白的指示剂和DAPI，并根据显示结果进行所述候选细胞的选择。


4.根据权利要求3所述的用于鉴定外周血中循环子宫内膜细胞的方法，其特征在于，所述指示剂包括抗体和与抗体偶联的可检测发光基团。


5.根据权利要求2所述的用于鉴定外周血中循环子宫内膜细胞的方法，其特征在于，利用CEP8检测所述候选细胞的染色体是否异常。


6.根据权利要求5所述的用于鉴定外周血中循环子宫内膜细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从受试者采集外周血，弃掉前2-3ml后，取6-8ml进行离心，弃上清后，加入清洗液混匀后，经密度梯度分离得到三层液体，取最上层和中间层液体混合，然后加入与磁珠结合的白细胞抗体，经磁分离后得到富集液相；
(2)向所述富集液相加入含柠檬酸钠的缓冲液，然后加入染色混合液进行结合反应，离心后去上清...

【专利技术属性】
技术研发人员：昌晓红，祝洪澜，王上，程洪艳，叶雪，
申请(专利权)人：北京大学人民医院，北京昂科未来医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11