一种用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的混合引物及其使用方法技术

本发明专利技术属于分子遗传学技术领域，具体提供了一种用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的混合引物及其使用方法。本发明专利技术的混合引物包括11对引物，各引物基于MDBK、BALB/c‑3T3、MDCK、Walker‑256、BHK‑21、Hela、FRhK‑4、Vero、CH0‑K1、PG‑4和PK‑15细胞的Cytb和CO I基因标准序列的差异而设计，大大减小了引物之间的交叉配对和干扰概率，提高了检测的特异性和灵敏度，只需对细胞DNA进行提取便可以同时对多种细胞的种属来源进行鉴别，还可以对培养过程中是否存在不同种属间细胞的交叉污染进行检测，具有操作简单、用时短、效率高和价格便宜等优势。

【技术实现步骤摘要】
一种用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的混合引物及其使用方法
本专利技术属于分子遗传学领域，具体涉及一种用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的混合引物及其使用方法。
技术介绍
随着哺乳动物细胞体外培养技术的日益成熟及其表达产物的生物学特性更接近人体的天然产物，哺乳动物细胞越来越受到科研工作者的重视，并常被用于病理学机制研究、药物筛选和生物制品生产等方面，据统计，大约70％的治疗性重组蛋白药物是由哺乳动物细胞生产。然而，哺乳动物有着相似的营养成分需求和培养环境条件，其在培养传代过程中，很容易发生细胞间交叉污染。德国DSMZ保藏中心的研究学者鉴定的252株细胞系中，至少18％的细胞系发生交叉污染。国际癌症杂志2010年公布的360种细胞系中，大多数发生种内交叉污染，9％的细胞系发生种间交叉污染。细胞间交叉污染不但会影响实验结果的准确性和重复性，导致药物筛选失败，同时也是生物制品生产的潜在威胁。目前，STR图谱分析法是细胞鉴别及交叉污染检测较为常用的方法，但该法适用于人源及鼠源少数物种细胞的种内细胞鉴别和交叉污染的检测。除此之外，染色体核型分析和同工酶技术也能够用于细胞鉴别及交叉污染检测，然而，此类检测方法具有细胞用量大、操作复杂、耗时及成本高等缺点，且检测效率极低。为提高检测效率，目前急需一种灵敏、快速、稳定的用于多细胞鉴别和种属间交叉污染检测的方法。线粒体基因是独立于基因组的遗传分子单元，其具有母系遗传、基因序列相对保守及突变率低等特点，常被分子遗传学家用于物种分类，种群遗传学及进化生物学等方面的分析。本专利基于十一个物种细胞线粒体上两个相对保守的基因细胞色素b(cytochromeb,Cytb)和细胞色素C氧化酶I(cytochromeCoxidasesubunitI，COI)基因序列差异设计出了多条扩增不同片段长度的引物，经过引物特异性筛选、引物组合检验和灵敏度检验，最终确定一套特异性强，灵敏度高的混合引物，并建立了一种用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的多重PCR检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有检测技术中细胞用量大、操作复杂、检测效率低、成本高等问题。为此，本专利技术提供了一种用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的混合引物，其包括以下引物对：(1)对牛MDBK细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅰ：正向引物：5’-AGCCCTAGTAGCAGACCTATTG-3’反向引物：5’-TTTGTTTTCGATTGTGCCGGCC-3’；(2)对小鼠BALB/c-3T3细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅱ：正向引物：5’-ACATACGAAAAACACACCCAT-3’反向引物：5’-TACTGATGAAAAGGCTGTTATT-3’；(3)对狗MDCK细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅲ：正向引物：5’-ATCCTTACTAGGAGTATGCTTG-3’反向引物：5’-CAGGTGAAAATAAAACTAGTGA-3’；(4)对大鼠Walker-256细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅳ：正向引物：5’-ATCAATCCTAATCTTAGCCTTC-3’反向引物：5’-GCTACTAGGATTCAGTAAAGGA-3’；(5)对叙利亚仓鼠BHK-21细胞的Cytb基因进行扩增的引物对Ⅴ：正向引物：5’-AGTTATAGCTACAGCATTCGTA-3’反向引物：5’-GTTATGAGGGCAATCAATAGTAG-3’；(6)对非洲绿猴Vero细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅵ：正向引物：5’-TGAATCTGAGGTGGGTACTCCATTGG-3’反向引物：5’-GGTTGTAATTAGGAATCAGAACAGG-3’；(7)对中国仓鼠CH0-K1细胞的COI基因进行特异性扩增的引物对Ⅶ：正向引物：5’-TTGGGAATTGATTAGTGCCTT-3’反向引物：5’-TGGTGTTTGGTATTGTGTAACA-3’；(8)对猫PG-4细胞的COI基因进行特异性扩增的引物对Ⅷ：正向引物：5’-TCTCAGGATATACCCTTGACAAC-3’反向引物：5’-GATGCGAAAGCTTCTCACACT-3’；(9)对人Hela细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅸ：正向引物：5’-ACGGGATCAAACAACCCCCTA-3’反向引物：5’-TCCGATTCAGGTTAGAATGAGG-3’；(10)对猪PK-15细胞的COI基因进行特异性扩增的引物对Ⅹ：正向引物：5’-ACCGTAGGAATAGACGTAGATACC-3’反向引物：5’-ATGCTGTGTATGCGTCAGGATAA-3’；(11)对恒河猴FRhK-4细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅺ：正向引物：5’-CCCTTACCTGAATTGGAAGCG-3’反向引物：5’-TTGTTTTCGATTAGGGAGGCC-3’。具体的，上述混合引物中所述引物对Ⅰ、所述引物对Ⅱ、所述引物对Ⅲ、所述引物对Ⅳ、所述引物对Ⅴ、所述引物对Ⅵ、所述引物对Ⅶ、所述引物对Ⅷ、所述引物对Ⅸ、所述引物对Ⅹ和所述引物对Ⅸ等比例混合。本专利技术还提供了一种多细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法，包括以下步骤：(1)制备待测细胞样品；(2)提取待测细胞的基因组DNA；(3)以待测细胞的基因组DNA为模板，利用上述用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的混合引物进行PCR扩增；(4)PCR反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据扩增产物的DNA片段大小来判定样品的来源细胞。具体的，上述步骤(3)中PCR扩增的反应体系为：10xPCR缓冲液2.5μl，DNA聚合酶0.5μl，DNA模板1μl，dNTPMix0.5μl，混合引物13μl，去离子水7.5μl。具体的，上述步骤(3)中PCR扩增的反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，进行35个循环；72℃完全延伸5min；16℃保存。具体的，上述步骤(4)中的判定依据为：牛MDBK细胞的引物对扩增出的DNA片段大小为148bp；小鼠BALB/c-3T3细胞的引物对扩增出的DNA片段大小为191bp；狗MDCK细胞的引物对扩增出的DNA片段大小为641bp；大鼠Walker-256细胞的引物对扩增出的DNA片段大小为102bp；叙利亚仓鼠BHK-21细胞的引物对扩增出的DNA片段大小为357bp；非洲绿猴Vero细胞的引物对扩增出的DNA片段大小为507bp；中国仓鼠CH0-K1细胞的引物对扩增出的DNA片段大小为314bp；猫PG-4细胞的引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的混合引物，其特征在于，包括以下引物对：/n(1)对牛MDBK细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅰ：/n正向引物：5’-AGCCCTAGTAGCAGACCTATTG-3’/n反向引物：5’-TTTGTTTTCGATTGTGCCGGCC-3’；/n(2)对小鼠BALB/c-3T3细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅱ：/n正向引物：5’-ACATACGAAAAACACACCCAT-3’/n反向引物：5’-TACTGATGAAAAGGCTGTTATT-3’；/n(3)对狗MDCK细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅲ：/n正向引物：5’-ATCCTTACTAGGAGTATGCTTG-3’/n反向引物：5’-CAGGTGAAAATAAAACTAGTGA-3’；/n(4)对大鼠Walker-256细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅳ：/n正向引物：5’-ATCAATCCTAATCTTAGCCTTC-3’/n反向引物：5’-GCTACTAGGATTCAGTAAAGGA-3’；/n(5)对叙利亚仓鼠BHK-21细胞的Cytb基因进行扩增的引物对Ⅴ：/n正向引物：5’-AGTTATAGCTACAGCATTCGTA-3’/n反向引物：5’-GTTATGAGGGCAATCAATAGTAG-3’；/n(6)对非洲绿猴Vero细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅵ：/n正向引物：5’-TGAATCTGAGGTGGGTACTCCATTGG-3’/n反向引物：5’-GGTTGTAATTAGGAATCAGAACAGG-3’；/n(7)对中国仓鼠CH0-K1细胞的CO I基因进行特异性扩增的引物对Ⅶ：/n正向引物：5’-TTGGGAATTGATTAGTGCCTT-3’/n反向引物：5’-TGGTGTTTGGTATTGTGTAACA-3’；/n(8)对猫PG-4细胞的COI基因进行特异性扩增的引物对Ⅷ：/n正向引物：5’-TCTCAGGATATACCCTTGACAAC-3’/n反向引物：5’-GATGCGAAAGCTTCTCACACT-3’；/n(9)对人Hela细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅸ：/n正向引物：5’-ACGGGATCAAACAACCCCCTA-3’/n反向引物：5’-TCCGATTCAGGTTAGAATGAGG-3’；/n(10)对猪PK-15细胞的COI基因进行特异性扩增的引物对Ⅹ：/n正向引物：5’-ACCGTAGGAATAGACGTAGATACC-3’/n反向引物：5’-ATGCTGTGTATGCGTCAGGATAA-3’；/n(11)对恒河猴FRhK-4细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅺ：/n正向引物：5’-CCCTTACCTGAATTGGAAGCG-3’/n反向引物：5’-TTGTTTTCGATTAGGGAGGCC-3’。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的混合引物，其特征在于，包括以下引物对：
(1)对牛MDBK细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅰ：
正向引物：5’-AGCCCTAGTAGCAGACCTATTG-3’
反向引物：5’-TTTGTTTTCGATTGTGCCGGCC-3’；
(2)对小鼠BALB/c-3T3细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅱ：
正向引物：5’-ACATACGAAAAACACACCCAT-3’
反向引物：5’-TACTGATGAAAAGGCTGTTATT-3’；
(3)对狗MDCK细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅲ：
正向引物：5’-ATCCTTACTAGGAGTATGCTTG-3’
反向引物：5’-CAGGTGAAAATAAAACTAGTGA-3’；
(4)对大鼠Walker-256细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅳ：
正向引物：5’-ATCAATCCTAATCTTAGCCTTC-3’
反向引物：5’-GCTACTAGGATTCAGTAAAGGA-3’；
(5)对叙利亚仓鼠BHK-21细胞的Cytb基因进行扩增的引物对Ⅴ：
正向引物：5’-AGTTATAGCTACAGCATTCGTA-3’
反向引物：5’-GTTATGAGGGCAATCAATAGTAG-3’；
(6)对非洲绿猴Vero细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅵ：
正向引物：5’-TGAATCTGAGGTGGGTACTCCATTGG-3’
反向引物：5’-GGTTGTAATTAGGAATCAGAACAGG-3’；
(7)对中国仓鼠CH0-K1细胞的COI基因进行特异性扩增的引物对Ⅶ：
正向引物：5’-TTGGGAATTGATTAGTGCCTT-3’
反向引物：5’-TGGTGTTTGGTATTGTGTAACA-3’；
(8)对猫PG-4细胞的COI基因进行特异性扩增的引物对Ⅷ：
正向引物：5’-TCTCAGGATATACCCTTGACAAC-3’
反向引物：5’-GATGCGAAAGCTTCTCACACT-3’；
(9)对人Hela细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅸ：
正向引物：5’-ACGGGATCAAACAACCCCCTA-3’
反向引物：5’-TCCGATTCAGGTTAGAATGAGG-3’；
(10)对猪PK-15细胞的COI基因进行特异性扩增的引物对Ⅹ：
正向引物：5’-ACCGTAGGAATAGACGTAGATACC-3’
反向引物：5’-ATGCTGTGTATGCGTCAGGATAA-3’；
(11)对恒河猴FRhK-4细胞的Cytb基因进行特异性扩增的引物对Ⅺ：
正向引物：5’-CCCTTACCTGAATTGGAAGCG-3’
反向引物：5’-TTGTTTTCGATTAGGGAGGCC-3’。


2.如权利要求1所述的用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的混合引物，其特征在于，所述混合引物中所述引物对Ⅰ、所述引物对Ⅱ、所述引物对Ⅲ、所述引物对Ⅳ、所述引物对Ⅴ、所述引物对Ⅵ、所述引物对Ⅶ、所述引物对Ⅷ、所述引物对Ⅸ、所述引物对Ⅹ和所述引物对Ⅸ等比例混合。


3.一种多细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法，包括以下步骤：
(1)制备待测细胞样品；
(2)提取待测细胞的基因组DNA；
(3)以待测细胞的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的混合引物进...

【专利技术属性】
技术研发人员：臧照星，幸晓莹，徐国东，刘愈杰，
申请(专利权)人：武汉珈创生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42