一种在全基因组水平鉴定植物基因组DNA鸟嘌呤四联体位点的方法技术

本发明专利技术公开一种在全基因组水平鉴定植物基因组DNA鸟嘌呤四联体位点的方法，该方法包括如下步骤：(1)交联固定植物材料；(2)提取并纯化细胞核；(3)对细胞核内染色质进行片段化处理回收DNA片段；(4)将回收的DNA片段进行变复性反应；(5)制备IP反应复合物；(6)用Protein G Beads回收过夜反应形成的IP反应复合物；(7)从Beads上洗脱IPed DNA，回收DNA片段；(8)用qPCR方法检测DNA G4富集程度；(9)将经过富集程度检测的IP DNA进行建库和Illumina测序，经过生物信息学分析实现在全基因组水平鉴定G4位点。整个方法流程简单，耗时较短，DNA片段化可视化效果强，理论上适合应用于多数植物物种。

【技术实现步骤摘要】
一种在全基因组水平鉴定植物基因组DNA鸟嘌呤四联体位点的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用BG4重组蛋白在全基因组水平鉴定植物基因组DNA鸟嘌呤四联体(G4)位点的新方法。
技术介绍
在真核生物基因组中，双链或单链DNA中富含鸟嘌呤(G)的某些区域，通过形成Hoogsteen氢键来稳定四个鸟嘌呤的平面结构，多个鸟嘌呤结构能够形成一个三维立体的四鸟嘌呤柱状体结构，这种结构称为DNA鸟嘌呤四联体结构(G-quadruplex,G4)(Quetal.,2018,AnalChem,90:12051-12058)。人类相关研究结果表明，G4结构在肿瘤基因的端粒维持、复制、转录和翻译等多种生物学过程中发挥着重要作用(Kumetaretal.,2011,NucleicAcidsRes.39:8005-8016)，特别是，G4在肿瘤端粒中生理功能相对比较活跃。但也有研究表明，DNAG4结构不仅广泛分布于癌变细胞中，而在正常细胞中也普遍存在。人体癌细胞系的研究表明，G4位点多集中在DNA端粒区并与DNA损伤修复机制可能有一定的相关性，表明DNAG4可能参与细胞对逆境胁迫下的防御反应，甚至参与到逆境损伤修复过程，从而推动了G4位点作为癌症治疗药物的靶标位点的应用转化研究。从而表明，G4是真核生物基因组中具有行使一定生物学功能的一种DNA高级结构，而不仅仅是冗余的基因组DNA序列。目前，用于鉴定人类细胞系G4结构的ChIP(Chromatinimmunoprecipitation)反应的抗体主要有BG4,D1等抗体(GiuliaBiffi,2013,NatureChemistry,5:182–186).最近，Giulia等人在人基因组中BG4蛋白末端连接FLAG标签，通过基因工程的方式制备出一种含有FLAG标签的BG4重组蛋白，经研究发现，该重组蛋白对基因组DNA中的G4结构具有特异识别作用，最终将BG4-ChIP-seq方法成功应用于人体多种不同细胞系的全基因组的G4位点的鉴定(Hansel-Hertsch,etal.,2018,NatProtoc,13:551-564)，从而为体外研究DNAG4结构提供了一种切实可行的方法。另外，现有的报道显示，基于DNAG4保守性核心序列(motif)的DNA-G4-seq方法可适用于多物种全基因组G4结构鉴定，并且该方法首次运用于在植物拟南芥，但该方法是否同样适用于其他植物，特别是作物，还有待于进一步验证。不过迄今为止，基于ChIP-seq方法在全基因组水平鉴定植物G4位点的方法未见报道。与本方法最接近的是G4ChIP-seq。该方法目前主要在人类基因组成功应用。它与一般的ChIP反应体系大致相同(Hansel-Hertsch,etal.,2018,NatProtoc,13:551-564)。首先需要对人细胞系进行交联处理，之后提取人体细胞系细胞核，用超声波Buffer重悬后对细胞核内染色质进行片段化处理，染色质破碎成为100-500bp的片段，然后将片段化的染色质与BG4重组蛋白进行免疫沉淀应用，通过Anti-FLAG-Beads将含有G4结构的染色质DNA片段捕获并沉淀下来，再将G4富集的DNA从Beads上洗脱下来，用DNA纯化剂盒将经过解交联，回收经ProteinaseK处理的ChIPed-DNA，通过建库测序以及生物信息学分析，最终在全基因组水平鉴定G4位点。人体细胞系应用BG4重组蛋白的BG4-ChIP-seq反应体系主要流程见附图1((Hansel-Hertsch,etal.,2018,NatProtoc,13:551-564))。该方法主要在体内染色质水平进行G4位点鉴定，但在植物材料中是否适用还有待于进一步验证。我们发展了一种基于人BG4重组蛋白的G4DNA-IP(immunoprecipitation)-seq方法(BG4-DNA-IP-seq)，并将该方法成功应用于在全基因组水平鉴定水稻，小麦和玉米的G4位点。该方法主要步骤包括：植物材料交联，提取和纯化细胞核，细胞核经超声波将染色质片段化成为100-500bp的片段，提取片段化染色质DNA并与BG4重组蛋白进行孵育，利用Anti-FLAG和ProteinGBeads捕获BG4特异结合的含有G4结构的DNA片段，经洗脱，解交联，ProteinaseK处理和酚仿抽提和酒精沉淀等步骤，最终获得G4富集的IPed-DNA，通过建库测序和生物信息学分析，从而在全基因组水平鉴定G4位点。主要技术流程见附图2。总之，该方法的发展和应用将有利于植物全基因组G4的生物学功能研究以及在农作物分子育种上的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用BG4重组蛋白在全基因组水平鉴定植物基因组DNA鸟嘌呤四联体(G4)位点的新方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种利用BG4重组蛋白鉴定植物基因组DNAG4位点的方法(BG4-DNA-IP-seq)，该方法主要包括如下步骤：(1)交联固定植物材料；(2)提取并纯化植物材料的细胞核；(3)对细胞核内染色质进行片段化处理(利用超声波破碎仪片段化染色质)，利用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测超声波片段化效果，选取片段化程度符合要求的样品进行解交联反应，回收DNA片段；(4)将回收的DNA片段在变复性Buffer(GCBBuffer)中进行变复性反应(即变性及复性反应)；(5)将IPBuffer加入到变复性产物中，继而加入BG4重组蛋白反应后再加入Anti-FLAG抗体过夜反应得到IP反应复合物；(6)用ProteinGBeads回收过夜反应后由BG4重组蛋白与DNA形成的IP反应复合物；(7)从Beads上洗脱IPedDNA，并用醇沉法回收DNA片段；(8)用qPCR方法检测DNAG4的富集程度；(9)将经过富集程度检测的IPDNA进行建库和Illumina测序，经生物信息学分析实现在全基因组水平鉴定G4位点。作为一种优选技术方案，步骤(1)中交联固定植物材料的过程为：将植物材料剪碎(大小约1～2cm)后浸泡于交联固定液中，在真空条件下进行交联反应；再向交联固定液中加入甘氨酸溶液并进行真空处理使多余的交联剂失活，最后得到交联固定的植物材料；用灭菌水多次清洗交联固定的植物材料，吸干表面的水分，将交联固定的植物材料用锡铂纸包裹后放置于液氮中进行速冻处理，最后将速冻材料取出于-80℃保存待用。进一步优选的，步骤(1)中交联固定植物材料的详细过程为：将植物材料剪碎后浸泡于交联固定液中，在真空条件下4℃交联8～15分钟；再向交联固定液中加入甘氨酸溶液后，在4℃条件下真空处理2～7分钟，倒掉交联固定液，无菌水洗材料三次，吸水纸吸干残留无菌水，用锡纸包裹并液氮速冻后保存在-80℃冰箱。所述的交联固定液包括：50mMHEPES(试剂pH＝7.5)、1mMEDTA(试剂pH＝8.0)、0.1MNaCl、1mMPMSF和终浓度为1％(v/v)的甲醛；所述甘氨酸溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用BG4重组蛋白鉴定植物基因组DNA G4位点的方法，其特征在于，该方法主要包括如下步骤：/n(1)交联固定植物材料；/n(2)提取并纯化植物材料的细胞核；/n(3)对细胞核内染色质进行片段化处理，选取片段化程度符合要求的样品进行解交联反应，回收DNA片段；/n(4)将回收的DNA片段在变复性Buffer中进行变复性反应；/n(5)将IP Buffer加入到变复性产物中，继而加入BG4重组蛋白反应后再加入Anti-FLAG抗体过夜反应得到IP反应复合物；/n(6)用Protein G Beads回收过夜反应形成的IP反应复合物；/n(7)从Beads上洗脱IPed DNA，并用醇沉法回收DNA片段；/n(8)用qPCR方法检测DNA G4富集程度；/n(9)将经过富集程度检测的IP DNA进行建库和Illumina测序，经过生物信息学分析实现在全基因组水平鉴定G4位点。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用BG4重组蛋白鉴定植物基因组DNAG4位点的方法，其特征在于，该方法主要包括如下步骤：
(1)交联固定植物材料；
(2)提取并纯化植物材料的细胞核；
(3)对细胞核内染色质进行片段化处理，选取片段化程度符合要求的样品进行解交联反应，回收DNA片段；
(4)将回收的DNA片段在变复性Buffer中进行变复性反应；
(5)将IPBuffer加入到变复性产物中，继而加入BG4重组蛋白反应后再加入Anti-FLAG抗体过夜反应得到IP反应复合物；
(6)用ProteinGBeads回收过夜反应形成的IP反应复合物；
(7)从Beads上洗脱IPedDNA，并用醇沉法回收DNA片段；
(8)用qPCR方法检测DNAG4富集程度；
(9)将经过富集程度检测的IPDNA进行建库和Illumina测序，经过生物信息学分析实现在全基因组水平鉴定G4位点。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中交联固定植物材料的过程为：将植物材料剪碎后浸泡于交联固定液中，在真空条件下进行交联反应；再向交联固定液中加入甘氨酸溶液并进行真空处理使多余的交联剂失活，最后得到交联固定的植物材料；将交联固定的植物材料清洗后吸干表面的水分，用锡铂纸包裹并于液氮中速冻后于-80℃保存待用；
所述的交联固定液包括：50mMHEPES、1mMEDTA、0.1MNaCl、1mMPMSF和终浓度为1％的甲醛；所述甘氨酸溶液的终浓度为125mM。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中提取并纯化植物材料细胞核的过程为：将交联后的植物材料用液氮研磨成粉末后，往粉末中加入核提取缓冲液，搅拌成匀浆后于冰上放置；然后过滤、离心、并且弃上清，再加入细胞核清洗液重悬细胞核，再次离心，弃上清液对细胞核进行纯化，重复细胞核清洗过程直到细胞核颜色为白色或淡黄色，用RSB缓冲液重悬细胞核，离心后弃尽上清，保留沉淀，即得到纯化的细胞核；
所述核提取缓冲液的配方为：20mMTris-HCl、50mMEDTA、5mMSpermidine、0.15mMspermine、40％Glycerol、0.1％Mercaptoethanol；
所述细胞核清洗液的配方为：20mMTris-HCl、50mMEDTA、5mMSpermidine、0.15mMspermine、40％Glycerol、0.1％Mercaptoethanol、0.5％TritonX-100；
所述RSB缓冲液的配方为：10mMTris-HCl、10mMNaCl、3mMMgCl2。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中对细胞核内染色质进行片段化处理和解交联反应的过程为：将纯化后的细胞核充分重悬于裂解缓冲液中，用非接触式超声波破碎仪处理细胞核悬浮液3～15个循环，检测片段化程度，如果经过片段化处理的DNA均匀的分布在100～500bp，则加入解交联试剂进行解交联反应；然后向反应液中加入RNaseA，于37℃水浴中孵育后，再加入ProteinaseK，于55℃水浴中孵育；用等体积的酚仿(1:1)抽提离心后保留上清液并加入Glycogen，1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置1h后，离心回收DNA，DNA沉淀用75％酒精清洗干燥后，用EB溶解；
所述裂解缓冲液的配方为50mMTris-HCl、10...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文利，冯逸龙，陶申童，张鹏越，高静静，罗振宇，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32