一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法，该方法是以斑马鱼为模型，通过获取神经丘周围巨噬细胞迁移个数用于评价栀子水提取物的抗炎活性，以及通过获取肠下静脉血管血栓形成时间用于评价栀子水提取物的抗血栓活性。本发明专利技术方法，以斑马鱼为模型，不仅能够评价栀子水提取物的抗炎活性，而且还能评价栀子水提取物的抗血栓活性，具有靶点明确、筛选速度快、筛选成本低、高通量、样品消耗少、重复性好等优点，有着较高的使用价值和应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法
本专利技术属于中药
，涉及一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法。
技术介绍
动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)是一个由多种细胞相互作用(如内皮细胞、核细胞、T细胞)，主要影响大、中动脉的慢性进行性炎症疾病。炎症反应可促进血栓的形成和发展，并最终导致血栓破裂。在这个发生发展过程中，血液中的单核巨噬细胞，包括骨髓来源的单核细胞和由单核细胞分化而来的巨噬细胞在血栓溶解部位呈现明显的高度聚集状态，提示其在血栓机化和再通中发挥着重要作用。研究发现，巨噬细胞可以吞噬性炎症细胞，填充AS损伤部位，积极参与胆固醇堆积，还可通过维持促炎微环境促进复杂和不稳定斑块的形成。此外，抗炎巨噬细胞有助于组织修复重塑和斑块稳定。因此，抑制单核巨噬细胞功能可抑制血栓的溶解过程，针对巨噬细胞作用的研究可能成为抗As治疗的突破口。目前，有关中药提取物发挥抗炎或抗血栓作用的研究尽管已有报道，然而它们仅仅都是从其中一种活性进行评价，忽视了炎症与血栓形成二者内在的联系，涉及同步考察某种中药提取物的抗炎和抗血栓作用较少。栀子(GardeniajasminoidesEllis)是茜草科栀子属一种常绿灌木，主产于江西、湖南等地。栀子的果实是传统中药材，具有抗炎镇痛、保肝利胆、降血糖等作用，是多种中药常用复方的组成成分。目前，有关栀子乙醇提取物的活性及成分研究较多，然而，涉及栀子水提物的研究报道并不多。在评价栀子提取物的药理活性时，主要集中在抗抑郁、抗氧化、降糖和抗血栓方面，采用合适的药理模型同时评价栀子提取物的抗炎及抗血栓活性未见报道。另外，已报道相关药理研究模型仅仅局限于体外细胞或小鼠模型，且活性评价仅仅也是侧重抗炎或抗血栓活性一种。同时采用小鼠等整体动物模型在实际的药物筛选过程中存在着各种问题，如个体空间占位大、养育成本高、繁殖量有限(筛选通量小)、寿命周期长(活性测试周期长)、样品的消耗量大等，因而大大限制了其应用于药物筛选和活性指导下的活性成分研究。采用一种靶向明确、成本低廉、筛选周期短、供试样品消耗少的筛选模型评价中药提取物的抗血栓和抗炎功能具有重要意义。目前，尚不清楚栀子水提物在斑马鱼模型上是否同时具有抗炎和抗血栓的功能。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种靶点明确、筛选成本低、筛选速度快、高通量、样品消耗少、重复性好的利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法，以斑马鱼为模型评价栀子水提取物的抗炎活性，包括以下步骤：S1、将栀子水提取物与斑马鱼胚胎混合，对斑马鱼胚胎进行孵育；S2、采用硫酸铜溶液对步骤S1中经孵育后得到的斑马鱼进行处理，造成急性炎症；S3、采用多聚甲醛溶液对步骤S2中经硫酸铜溶液处理后得到的斑马鱼进行固定处理；S4、采用荧光显微镜观察步骤S3中经多聚甲醛溶液固定处理后的斑马鱼的巨噬细胞炎症反应，计数神经丘周围巨噬细胞迁移个数；S5、以步骤S4中得到神经丘周围巨噬细胞迁移个数为评价指标，用于评价栀子水提取物的抗炎活性。上述的方法，进一步改进的，所述步骤S5中，所述神经丘周围巨噬细胞迁移个数＜12.75±6.714个，且差异系数P＜0.05时，提示栀子水提取物对斑马鱼具有抗炎作用。上述的方法，进一步改进的，所述步骤S1中，所述孵育在光照条件下进行；所述孵育的温度为28℃；所述孵育的时间为24h；所述步骤S2中，所述采用硫酸铜溶液的浓度为20μM；所述处理的时间为1h；所述步骤S3中，所述固定处理后还包括以下步骤：去除斑马鱼上的多聚甲醛溶液，然后采用PBST溶液对斑马鱼进行清洗；所述多聚甲醛溶液的质量浓度为4％；所述固定处理的时间为1h。上述的方法，进一步改进的，所述步骤S1中，所述斑马鱼胚胎由巨噬细胞荧光转基因斑马鱼交配受精后培养得到。上述的方法，进一步改进的，所述栀子水提取物由以下方法制备得到：将栀子粉碎，过筛，加入水，超声提取，得到提取液；将提取液进行过滤，得到滤液；将滤液进行减压浓缩，回收溶剂，冷冻干燥，得到栀子水提取物。上述的方法，进一步改进的，所述栀子的质量与水的体积的比值范围为1g∶5mL～10mL；所述过筛为过40目筛；所述超声提取的次数为3次，单次超声提取的时间范围为30min～60min；所述减压浓缩在温度范围为40℃～60℃下进行。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法，以斑马鱼为模型评价栀子水提取物的抗血栓活性，包括以下步骤：(1)将栀子水提取物与斑马鱼胚胎混合，对斑马鱼胚胎进行孵育；(2)采用三氯化铁溶液对步骤(1)中经孵育后得到的斑马鱼进行处理，诱导血栓形成；(3)从加入三氯化铁溶液开始，记录肠下静脉血管形成血栓的时间；(4)以步骤(3)中得到肠下静脉血管血栓形成时间为评价指标，用于评价栀子水提取物的抗血栓活性。上述的方法，进一步改进的，所述步骤(4)中，所述肠下静脉血管血栓形成时间≥8.84±0.10min，且差异系数P＜0.05时，提示栀子水提取物对斑马鱼具有抗血栓作用。上述的方法，进一步改进的，所述步骤(1)中，所述孵育在光照条件下进行；所述孵育的温度为28℃；所述孵育的时间为48h；所述步骤(2)中，所述三氯化铁溶液的浓度为60μg/mL。上述的方法，进一步改进的，所述步骤(1)中，所述斑马鱼胚胎由AB系斑马鱼交配受精后培养得到。上述的方法，进一步改进的，所述栀子水提取物由以下方法制备得到：将栀子粉碎，过筛，加入水，超声提取，得到提取液；将提取液进行过滤，得到滤液；将滤液进行减压浓缩，回收溶剂，冷冻干燥，得到栀子水提取物。上述的方法，进一步改进的，所述栀子的质量与水的体积的比值范围为1g∶5mL～10mL；所述过筛为过40目筛；所述超声提取的次数为3次，单次超声提取的时间范围为30min～60min；所述减压浓缩在温度范围为40℃～60℃下进行。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术提供了一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法，以斑马鱼为模型，不仅能够评价栀子水提取物的抗炎活性，而且还能评价栀子水提取物的抗血栓活性，具有靶点明确、筛选速度快、筛选成本低、高通量、样品消耗少、重复性好等优点，有着较高的使用价值和应用前景。附图说明为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。图1为本专利技术实施例1中不同样品处理斑马鱼后巨噬细胞的荧光电镜图，其中a为空白对照组，b为模型组，c为阳性药物组，d为栀子水提取物组(浓度为1μg/mL)，e为栀子水提取物组(浓度为5μg/mL)，f为栀子水提取物组(浓度为10μg/mL)具体实施方式<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法，其特征在于，以斑马鱼为模型评价栀子水提取物的抗炎活性，包括以下步骤：/nS1、将栀子水提取物与斑马鱼胚胎混合，对斑马鱼胚胎进行孵育；/nS2、采用硫酸铜溶液对步骤S1中经孵育后得到的斑马鱼进行处理，造成急性炎症；/nS3、采用多聚甲醛溶液对步骤S2中经硫酸铜溶液处理后得到的斑马鱼进行固定处理；/nS4、采用荧光显微镜观察步骤S3中经多聚甲醛溶液固定处理后的斑马鱼的巨噬细胞炎症反应，计数神经丘周围巨噬细胞迁移个数；/nS5、以步骤S4中得到神经丘周围巨噬细胞迁移个数为评价指标，用于评价栀子水提取物的抗炎活性。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法，其特征在于，以斑马鱼为模型评价栀子水提取物的抗炎活性，包括以下步骤：
S1、将栀子水提取物与斑马鱼胚胎混合，对斑马鱼胚胎进行孵育；
S2、采用硫酸铜溶液对步骤S1中经孵育后得到的斑马鱼进行处理，造成急性炎症；
S3、采用多聚甲醛溶液对步骤S2中经硫酸铜溶液处理后得到的斑马鱼进行固定处理；
S4、采用荧光显微镜观察步骤S3中经多聚甲醛溶液固定处理后的斑马鱼的巨噬细胞炎症反应，计数神经丘周围巨噬细胞迁移个数；
S5、以步骤S4中得到神经丘周围巨噬细胞迁移个数为评价指标，用于评价栀子水提取物的抗炎活性。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S5中，所述神经丘周围巨噬细胞迁移个数＜12.75±6.714个，且差异系数P＜0.05时，提示栀子水提取物对斑马鱼具有抗炎作用。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述孵育在光照条件下进行；所述孵育的温度为28℃；所述孵育的时间为24h；
所述步骤S2中，所述采用硫酸铜溶液的浓度为20μM；所述处理的时间为1h；
所述步骤S3中，所述固定处理后还包括以下步骤：去除斑马鱼上的多聚甲醛溶液，然后采用PBST溶液对斑马鱼进行清洗；所述多聚甲醛溶液的质量浓度为4％；所述固定处理的时间为1h。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述斑马鱼胚胎由巨噬细胞荧光转基因斑马鱼交配受精后培养得到。


5.一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法，其特征在于，以斑马鱼为模型...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐伟卓，陈建荣，曾志红，
申请(专利权)人：长沙学院，
类型：发明
国别省市：湖南;43