【技术实现步骤摘要】
一种蓝莓果实瞬时表达的方法、系统与应用
本专利技术属于农业生物
,涉及一种蓝莓果实瞬时表达的方法、系统与应用,特别涉及一种基于真空渗入的蓝莓果实瞬时表达的方法、系统与ACO1基因过表达的应用。
技术介绍
瞬时转染是将DNA导入真核细胞的方式之一。在瞬时转染中,重组DNA导入感染性强的细胞系以获得目的基因暂时且高水平的表达。目前果实中常用的瞬时表达方法为注射法,但该方法多适用于番茄、草莓等果肉较为柔软的果实中。蓝莓(拉丁文:VacciniumSpp,英文:Blueberry),又名越桔,蓝浆果,属杜鹃花科(Ericaceae)越桔亚科(Vaccinioideae)越桔属(Vacciniodeae)植物。蓝莓营养丰富,不仅富含常规营养成分,而且还含有极为丰富的黄酮类与多糖类化合物。蓝莓果实含有防止脑神经衰老、增强心脏功能、明目及抗癌等功效物质。由于蓝莓果实细胞结合太过紧密,果实的结构、特性与以往研究的果实不同,用于普通果实的瞬时表达方法不适用于蓝莓果实,因此针头注射的方法不可行。由于农杆菌只有在特定诱导因子存在时才能侵染植物组织伤口处的细胞,而这些研究中均直接使用注射方式进行侵染,侵染效率严重受限。后续的研究工作对在蓝莓果实中的瞬时转染效率有较高的要求,因此一种高效的蓝莓果实瞬时转染方法需求非常迫切。
技术实现思路
本专利技术具体涉及一种基于真空渗入的蓝莓果实瞬时表达的方法。该方法包括用农杆菌侵染液悬浮活化后的农杆菌;将蓝莓果实用牙签头扎孔;将蓝莓果实置于农杆菌侵染液中, ...
【技术保护点】
1.一种用于蓝莓果实基因表达的方法,所述方法包括如下步骤:/nS1:将蓝莓果实表面打孔,得到经打孔的蓝莓果实;/nS2:将所述经打孔的蓝莓果实浸入农杆菌侵染悬液,得到蓝莓果实侵染悬液混合物;/n所述农杆菌侵染悬液包括重组农杆菌和农杆菌侵染液;/n所述重组农杆菌为含有T-DNA给体载体和TI辅助质粒的根癌农杆菌宿主菌;/n所述T-DNA给体载体的T-DNA片段中含有具有表达元件的目的基因,具有表达元件的用于插入目的基因的位点,或者有具有表达元件的用于置换目的基因的DNA片段;/n所述农杆菌侵染液中含有2-(N-吗啉)乙磺酸,氯化镁,乙酰丁香酮;/nS3:将所述蓝莓果实侵染悬液混合物放入真空环境,得到经真空处理的蓝莓果实,所述真空环境的压强为0.01-0.085MPa,处理时间为3-15min。/n
【技术特征摘要】
1.一种用于蓝莓果实基因表达的方法,所述方法包括如下步骤:
S1:将蓝莓果实表面打孔,得到经打孔的蓝莓果实;
S2:将所述经打孔的蓝莓果实浸入农杆菌侵染悬液,得到蓝莓果实侵染悬液混合物;
所述农杆菌侵染悬液包括重组农杆菌和农杆菌侵染液;
所述重组农杆菌为含有T-DNA给体载体和TI辅助质粒的根癌农杆菌宿主菌;
所述T-DNA给体载体的T-DNA片段中含有具有表达元件的目的基因,具有表达元件的用于插入目的基因的位点,或者有具有表达元件的用于置换目的基因的DNA片段;
所述农杆菌侵染液中含有2-(N-吗啉)乙磺酸,氯化镁,乙酰丁香酮;
S3:将所述蓝莓果实侵染悬液混合物放入真空环境,得到经真空处理的蓝莓果实,所述真空环境的压强为0.01-0.085MPa,处理时间为3-15min。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述基因表达为瞬时基因表达;
优选地,在步骤S1中,所述蓝莓果实选自大绿期的蓝莓果实;
优选地,在步骤S1中,打孔的深度为4-5mm;
优选地,在步骤S1中,打孔的内径为1-2mm;
优选地,在步骤S1中,一枚蓝莓果实打孔的个数为3-10;
优选地,在步骤S1中,一枚蓝莓果实打孔的不同孔之间间距为5-15mm;
优选地,在步骤S1中,使用无菌针状物或无菌杆状物进行所述打孔。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤S2中,将所述T-DNA给体载体和所述Ti辅助质粒同时或相继转化所述根癌农杆菌宿主菌,形成所述重组农杆菌;
优选地,在步骤S2中,将所述T-DNA给体载体转化含有所述Ti辅助质粒的所述根癌农杆菌宿主菌,形成所述重组农杆菌;
优选地,在步骤S2中,采用Gateway克隆方法,将所述目的基因重组到所述T-DNA给体载体;
优选地,在步骤S2中,所述含有所述Ti辅助质粒的所述根癌农杆菌宿主菌为根癌农杆菌GV3101或根癌农杆菌EHA105;
优选地,在步骤S2中,所述T-DNA给体载体中,所述目的基因的启动子为NOS启动子、MAS启动子或CaMV35S启动子;
优选地,在步骤S2中,所述T-DNA给体载体中,所述目的基因的终止子为NOS终止子;
优选地,在步骤S2中,所述T-DNA给体载体为双元表达载体;
优选地,在步骤S2中,所述T-DNA给体载体为双元表达载体pCAMBIA-1303或双元表达载体GatewayTM293载体;
优选地,在步骤S2中,所述农杆菌侵染液的组成成分为:8-12mMMgCl2,150-250μM乙酰丁香酮,8-12mM2-(N-吗啉)乙磺酸,水溶液,pH5.0-6.0;
优选地,在步骤S2中,所述农杆菌侵染液用孔径为0.02μm的滤头过滤除菌后使用;
优选地,在步骤S2中,所述重组农杆菌的增殖培养基为含有抗生素的LB液体培养基;
优选地,在步骤S2中,所述重组农杆菌的增殖培养基为含有30-80mg/l利福平和50-150mg/l卡那霉素的LB液体培养基;
优选地,在步骤S2中,所述重组农杆菌的增殖培养到使用浓度为OD600=0.5-1.0;
优选地,在步骤S2中,农杆菌侵染悬液的制备步骤为:
将所述重组农杆菌的培养物离心,去除上清,得到第一沉淀;
用所述农杆菌侵染液清洗第一沉淀,离心,去除上清,得到第二沉淀;
将所述第二沉淀用所述农杆菌侵染液重悬,得到所述农杆菌侵染悬液;
优选地,在步骤S2中,每次离心的条件为:4000-8000rpm下离心3-10min;
优选地,在步骤S2中,所述农杆菌侵染液经活化后使用,活化的步骤为:用LB液体培养基培养所述重组农杆菌至菌液OD600=0.5-1.0;优选地,在步骤S2中,所述目的基因为EGFP基因;
优选地,在步骤S3中,所述真空环境的压强为0.016-0.08MPa;
优选地,在步骤S3中,处理时间为5-10min;
优选地,在步骤S3中,将经真空处...
【专利技术属性】
技术研发人员:周扬颜,莫翱玮,陈文秀,孙卫健,郭鹏,许鹏昊,
申请(专利权)人:山东大丰园农业有限公司,
类型:发明
国别省市:山东;37
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