一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗及其制备方法，是由RBD‑Fd基因与真核表达载体结合，通过转化大肠杆菌感受态制备的，其免疫原性更强、所需免疫剂量更低、毒副反应也更低。同时，本疫苗是以pFUSE‑mIgG3‑Fc1为载体骨架分子，对抗原基因与IgG‑Fc片段进行融合，可提高疫苗的抗原半衰期、热稳定性、pH耐受性。其诱导的中和抗体效价可达1:2048，是SARS‑CoV‑2 DNA疫苗INO‑4800的20倍，是一种猪PEDV‑TGEV二联DNA疫苗的12倍。

【技术实现步骤摘要】
一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗及其制备方法
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗及其制备方法。
技术介绍
猪血凝性脑脊髓炎（PorcineHemagglutinatingEncephalomyelitis，PHE），是由猪血凝性脑脊髓炎病毒（PorcineHemagglutinatingEncephalomyelitisVirus，PHEV）引起的猪急性、高度接触性传染病，致死率为30%~100%。该病于50年代末期首先发现于加拿大，目前已呈世界性分布，严重危害全球养猪业的健康发展。猪血凝性脑脊髓炎根据临床症状的不同，主要划分为三种亚型：呕吐衰竭型、神经型和流感型。呕吐衰竭型多见于哺乳仔猪，发病仔猪与多种冠状病毒（如猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪丁型冠状病毒等）感染仔猪相似，表现为消化系统障碍；神经型亦多见于哺乳仔猪，发病仔猪的临床症状与仔猪伪狂犬病易发生混淆，均表现显著的神经症状，且死亡率为100%；流感型多见于成年猪只，其发病特征类似于猪流感，表现为流感样呼吸系统障碍。PHEV一般分布于病猪及带毒猪的上呼吸道及脑组织中，通常经口、鼻等呼吸道分泌物传播。由于尚缺乏针对该病的的治疗药物，疫苗的使用依然是阻止猪血凝性脑脊髓炎感染和疫情传播的有效手段。PHEV为单股正链RNA病毒，与重症急性呼吸道综合症冠状病毒（SARS-CoV）、新型冠状病毒（SARS-CoV-2）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）、牛冠状病毒（BCoV）及鼠肝炎病毒（MHV）等同属于冠状病毒科、β冠状病毒属成员。PHEV基因组编码五种结构蛋白，分别为棘突糖蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）和血凝素蛋白（HE）。S蛋白是由S1和S2亚基形成的三聚体（即S三聚体），其中S1亚基内部包含受体结合域（receptorbindingdomain，RBD），通过空间构象重塑介导病毒与宿主细胞受体识别、吸附和侵入过程，是疫苗设计的良好靶标。当前，主要有5条技术路线进行冠状病毒疫苗的研发，即灭活病毒疫苗、核酸疫苗（包括DNA疫苗和mRNA疫苗）、腺病毒载体疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗。DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，被称为继灭活疫苗、弱毒疫苗、亚单位疫苗之后的“第三代疫苗”是将编码免疫原或与免疫原相关的真核表达质粒DNA导入宿主体内，诱导机体产生特异性的体液和细胞免疫反应。由于DNA疫苗的制备工艺相对简单、生产成本低、无感染性、开发与生产周期短等优势，已成为多种人类和动物疫病防控的一个强有力的技术平台。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗及其制备方法。一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗基因RBD-Fd，它包括：P-S-RBD、柔性Linker、foldon（Fd）标签、Flag标签；所述的一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗基因RBD-Fd，其特征在于：所述的基因RBD-Fd，它的碱基序列如序列表SEQIDNO.5所示；一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗，它是在真核表达载体中插入了如序列表SEQIDNO.5所示的基因；所述的真核表达载体为pFUSE-mIgG-Fc1；一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗的制备方法，它包括：1）P-S-RBD基因的获得提PHEV细胞培养物的总RNA，逆转录为cDNA，以之为模板；设计引物：P-S-RBD上游引物：5’-GAATTCATGTGATTTACCCAATTGCGATATC-3’；P-S-RBD下游引物：5’-GAAGGATCTGGTTGACACCAGCAAG-3’，进行PCR反应，获得产物；2）Fd标签基因的获得人工合成Fd基因序列，在其5’端插入柔性Linker基因序列，在其3’端插入Flag基因序列和BglⅡ酶切位点；3）RBD-Fd基因的获得以P-S-RBD基因和Linker-Fd-Flag标签基因互为模板，加入上、下游引物，在高保真扩增酶的作用下，获得优化的RBD-Fd基因序列，所述的上、下游引物为：上游引物：5’-GAATTCATGTGATTTACCCAATTGCGATATC-3’；下游引物：5’-AGATCTCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAATCT-3’；4）构建重组质粒pFUSE-RBD-Fd-Fc1RBD-Fd基因插入pFUSE-mlgG3-Fc1载体中，构建重组质粒pFUSE-RBD-Fd-Fc1；5）扩增。本专利技术的有益效果在于：本新型猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗，将传统RBD序列C-末端连接Fd标签，可以确保DNA疫苗基因在真核细胞中表达为融合蛋白的三聚体结构，能最大程度的模拟天然病毒蛋白结构，其免疫原性更强、所需免疫剂量更低、毒副反应也更低。同时，本DNA疫苗是以pFUSE-mIgG3-Fc1为载体骨架分子，对抗原基因与IgG-Fc片段进行融合，可提高疫苗的抗原半衰期、热稳定性、pH耐受性。实施例验证，相较于其他冠状病毒（如SARS-CoV-2、PEDV、TGEV等）DNA疫苗，本新型DNA疫苗诱导的抗原特异性免疫反应显著增强，其诱导的中和抗体效价可达1:2048，是SARS-CoV-2DNA疫苗INO-4800的20倍，是一种猪PEDV-TGEV二联DNA疫苗的12倍。本专利技术对于猪血凝性脑脊髓炎的防控具有重大价值。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为实施例1提供的PCR产物电泳的结果图，600bp条带为P-S-RBD基因（597bp加起始密码子ATG）；135bp条带为Linker-Fd-Flag标签基因；735bp条带为RBD-Fd基因；图2为实施例2提供的DNA疫苗质粒双酶切鉴定结果图，4132bp条带为pFUSE-mIgG3-Fc1载体基因；735bp条带为RBD-Fd基因；图3为实施例2提供的DNA疫苗Westernblot鉴定结果图，55kD-70kD之间蛋白条带为P-S-RBD蛋白；图4为实施例3提供的酶联免疫吸附法检血清中特异性IgG抗体结果图；图5为实施例3提供的微量中和试验检测血清中和抗体结果图；图6为实施例3提供的流式细胞检测细胞因子结果图，1-5分别代表2ugRBD组、4ugRBD组、Ctrl组、PBS组和FA组。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步的详细描述。下述实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照分子生物学、分子病毒学、分子免疫学、细胞生物学等领域内的文献所描述的技术或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1重组质粒pFUSE-RBD-Fd-Fc1的构建（1）P-S-RBD基因的获本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗基因 RBD-Fd，它包括：P-S-RBD、柔性Linker、Fd标签、Flag标签。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗基因RBD-Fd，它包括：P-S-RBD、柔性Linker、Fd标签、Flag标签。


2.根据权利要求1所述的一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗基因RBD-Fd，其特征在于：所述的基因RBD-Fd，它的碱基序列如序列表SEQIDNO.5所示。


3.一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗，它是在真核表达载体中插入了如序列表SEQIDNO.5所示的基因。


4.根据权利要求3所述的一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗，其特征在于：所述的真核表达载体为pFUSE-mIgG-Fc1。


5.一种猪血凝性脑脊髓炎DNA疫苗的制备方法，它包括：
1）P-S-RBD基因的获得
提PHEV细胞培养物的总RNA，逆转录为cDNA，以之为模板；设计引物：
P-S-RBD上游引物：5’-GAATTCATGTGATTTACCCAATTGCGATATC-3’...

【专利技术属性】
技术研发人员：李姿，贺文琦，田轶涵，邸雪梅，高丰，陆慧君，兰云刚，赵魁，关继羽，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22