一种草鱼呼肠孤病毒GCRV-WL1609及RT-PCR检测引物及应用制造技术

本发明专利技术属于病毒检测领域，具体公开了一种草鱼呼肠孤病毒WL1609及RT‑PCR检测引物及应用，发明专利技术人首次从草鱼中分离出了一种草鱼呼肠孤病毒弱毒株，为天然缺失基因型毒株，所述的草鱼呼肠孤病毒的保藏编号为：CCTCC NO：V201978，该病毒在S9节段（编码VP6蛋白）的编码区1043~1057 bp处有15bp的核苷酸缺失。针对该病毒序列设计引物F1：5'‑GAGGCCATAGTCTCGGAAGC‑3'，F2：5'‑GCGTACAATGCTGATGGACG‑3'，R：5'‑CCAGTACGTGTCAATAGCGT‑3'。可对草鱼呼肠孤病毒进行检测，该引物的特异性好，灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
一种草鱼呼肠孤病毒GCRV-WL1609及RT-PCR检测引物及应用
本专利技术属于鱼类病毒分子生物学检测领域，具体涉及一种草鱼呼肠孤病毒WL1609及RT-PCR检测引物及应用。技术背景草鱼出血病是严重危害草鱼健康养殖的一种病毒性疾病，致死率可达90％以上，每年由于该病导致的经济损失达十数亿元。草鱼出血病的病原为草鱼呼肠孤病毒，该病毒粒子直径约为60～70nm，呈二十面体对称，具有双层衣壳，无囊膜，基因组由11条分节段的双链RNA组成。1991年国际病毒分类委员会第五次会议将该病毒正式命名为草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus,GCRV),并纳入呼肠孤病毒科(Reoviridae)、水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus)。目前我国已报道的GCRV分离株有50多株，根据基因序列差异可分为3个基因型：以GCRV-873毒株为代表的I型、GCRV-HZ08毒株为代表的II型和HGDRV毒株为代表的III型。流行病学调查分析表明，当前我国的草鱼出血病呈现出不同基因型病毒单独感染和混合感染的态势，其中Ⅱ型GCRV占96％以上，为当前的主要流行基因型，对草鱼的致死率在90％以上。申请人此前已公开了4株草鱼呼肠孤病毒II型毒株，毒株名字及其基因组GenBank号分别为：GCRV106(GenBank：KC201166～KC201176)、GCRV918(GenBank：KC201177～KC201187)、GCRV-HuNan794(GenBank：KC238676～KC238686)、GCRV-HeNan988(GenBank：KC847320～KC847330)，这4株II型草鱼呼肠孤病毒均为强毒株，对草鱼的致死率均在90％以上。目前已公开的II型草鱼呼肠孤病毒弱毒株有3株：(1)高彩霞等人报道分离获得了一个II型GCRV弱毒株，该弱毒株命名为草鱼呼肠孤病毒II型CQ180701(高彩霞等，两株Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的分离、鉴定及生物学特性比较，水产学报，2020；《两株Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒新分离株生物学特性的比较》，2018年中国水产学会学术年会论文摘要集，高彩霞等)，这两篇中涉及到的CQ180701为同一株弱毒株；(2)曾伟伟等报道分离获得了一个II型草鱼呼肠孤病毒弱毒株命名为GCRVII-GD1207(曾伟伟等，一种草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型弱毒株及其应用，专利技术专利申请日2020.04.29)；(3)赵长臣等报道分离获得了一个II型草鱼呼肠孤病毒弱毒株命名为GCRV-GD108ca(赵长臣等，II型草鱼呼肠孤病毒冷适应株GCRV-GD108ca及其应用)；草鱼呼肠孤病毒基因组结构的一个显著特征就是，每个节段的5'和3'末端都有相同的保守序列，而专利中弱毒株GCRV-GD108ca的两个片段S9和S11均没有得到完整的5'和3'末端保守序列，但这两个片段中间的ORF都是完整的，没有缺失，且与已知II型毒株高度同源，说明其编码的蛋白也是高度同源的。由此推测这个弱毒株的致弱原因也不是因为缺失所致。通过对这3株公开的II型草鱼呼肠孤病毒弱毒株的基因节段序列分析表明，这3株弱毒株基因组节段都是完整的，因此这3株均不是缺失株。与公开的3株草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型弱毒株相比，申请人分离鉴定的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型弱毒株GCRV-WL1609一个最明显特征就是该毒株为缺失株。由于草鱼呼肠孤病毒为分节段的双链RNA病毒，这种病毒的基因组特征决定了不同节段之间容易发生重组，所以推测已公开的3株草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型弱毒株的致弱机制可能是由于片段重组所致，而申请人分离鉴定的这个草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型弱毒株GCRV-WL1609致弱机制可能是由于片段缺失导致。在自然界中，重组病毒相对较为普遍，而缺失毒株则较为罕见。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种草鱼呼肠孤病毒WL1609(GCRV-WL1609)，所述的病毒已于2019年10月30日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：草鱼呼肠孤病毒GCRV-WL1609株，保藏编号：CCTCCNO：V201978，地址：中国武汉武汉大学。本专利技术的另一个目的在于提供了基于草鱼呼肠孤病毒WL1609的特异性序列，所述序列为SEQIDNO.9所示，利用该序列与其他病毒的全序列的差异设计引物，利用该引物可用于检测草鱼呼肠孤病毒WL1609。本专利技术的还有一个目的在于提供一种草鱼呼肠孤病毒WL1609的RT-PCR检测引物，所述的引物为F1：5'-GAGGCCATAGTCTCGGAAGC-3'，F2：5'-GCGTACAATGCTGATGGACG-3'，R：5'-CCAGTACGTGTCAATAGCGT-3'。本专利技术还有一个目的在于提供了草鱼呼肠孤病毒WL1609的应用，所述的应用包括利用该病毒制备成草鱼出血病疫苗。本专利技术的最后一个目的在于提供一种草鱼呼肠孤病毒WL1609RT-PCR检测引物的应用，包括利用所述的应用制备成草鱼呼肠孤病毒检测试剂盒。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种草鱼呼肠孤病毒WL1609，所述的病毒分离自草鱼肝细胞，该病毒已于2019年10月30日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：草鱼呼肠孤病毒GCRV-WL1609株，保藏编号：CCTCCNO：V201978，地址：中国武汉武汉大学。将草鱼呼肠孤病毒WL1609(本专利技术或称为GCRV-WL1609)接种到草鱼肝细胞(Grasscarpliver)L8824单层，25℃培养7天，均没有见到明显的细胞病变，也就是说该毒株不能使草鱼肝细胞产生CPE(细胞病变效应)。培养基：M199，10％胎牛血清，pH7.0～7.2草鱼呼肠孤病毒WL1609的形态特征：病毒颗粒具有双层衣壳、无囊膜、呈5:3:2立体对称的正二十面体，其直径约为50-70nm，与典型的草鱼呼肠孤病毒颗粒相似。草鱼呼肠孤病毒WL1609的应用，所述的应用包括利用该病毒制备成草鱼出血病疫苗。本专利技术的保护内容还包括基于草鱼呼肠孤病毒WL1609的特异性序列(SEQIDNO.9所示)与其他病毒的全序列的差异设计的引物，所述的引物包括基于该差异序列，利用现有技术设计的诸如荧光定量引物，LAMP引物，数字PCR引物等，利用该引物可用于检测草鱼呼肠孤病毒WL1609。一种草鱼呼肠孤病毒WL1609RT-PCR检测引物，包括F1：5'-GAGGCCATAGTCTCGGAAGC-3'，F2：5'-GCGTACAATGCTGATGGACG-3'，R：5'-CCAGTACGTGTCAATAGCGT-3'。一种草鱼呼肠孤病毒WL1609RT-PCR检测引物的应用，包括利用上述引物制备成用于检测草鱼呼肠孤病毒检测试剂盒，或直接用于草鱼呼肠孤病毒的检测。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1.申请人从草鱼肝细胞中分离鉴定了一种草鱼呼肠孤病毒WL1609，并获得了该病毒的全基因组序列。通过全基因组序列比对，发现该毒株本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus），所述的草鱼呼肠孤病毒的保藏编号为：CCTCC NO：V201978。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离的草鱼呼肠孤病毒（Grasscarpreovirus），所述的草鱼呼肠孤病毒的保藏编号为：CCTCCNO：V201978。


2.权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒的特异性基因，所述基因为SEQIDNO.9所示。


3.针对权利要求2所述的特异性基因设计的检测引物。


4.权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒的检测引物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：范玉顶，周勇，薛明洋，刘文枝，曾令兵，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院长江水产研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42