一种从黑色素瘤细胞中提取黑色素的方法技术

本发明专利技术涉及一种从黑色素瘤细胞中提取黑色素的方法，是收集体外培养黑色素瘤细胞的细胞培养液，先离心除去沉淀物，再通过膜裂解的方式破坏细胞分泌出的囊泡结构，利用超滤离心或透析的方法除去除黑色素外的其他内容物进行纯化后，干燥得到水溶性良好的黑色素纳米粒子。本发明专利技术借助“废物利用”理念，采用简单的处理工艺，直接制备得到水溶性的小尺寸黑色素纳米粒子，具有良好的生物组织相容性，在药物或药物载体方面具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种从黑色素瘤细胞中提取黑色素的方法
本专利技术属于黑色素制备
，涉及一种水溶性黑色素纳米粒子的制备方法，特别是涉及一种利用黑色素瘤细胞废弃培养基提取水溶性黑色素纳米粒子的方法。
技术介绍
黑色素是一种生物色素，具有多种生物功能，包括结构着色、光保护、光致敏、自由基清除、螯合金属离子、抗氧化活化和神经保护等。此外，黑色素还可以作为天然药物载体，负载抗癌药物等，在癌症诊疗一体化中发挥重要作用。黑色素既可以通过酪氨酸及其衍生物经一系列化学反应合成得到，也可以从动物、植物或原生生物中提取得到。从生物体中提取黑色素，是一种常见的获取黑色素的方法。可用于提取黑色素的生物体主要包括墨鱼、鱿鱼、乌骨鸡、菜粕、山杏核壳、黑萝卜、黑米等。但是，从生物体中直接提取黑色素，不仅需要进行繁琐的后处理，而且提取出来的多是微米级颗粒，还需要通过超声细胞破碎机破碎、球磨、研磨或者碱液剪切等“自上而下”或“自下而上”的方法进行处理，才能获得黑色素纳米颗粒。然而，这样获得的黑色素纳米颗粒的水溶性仍然较差，还需要进一步通过PEG等方法制备成水溶性的黑色素纳米粒子。例如，CN109320993A公开了一种天然黑色素纳米颗粒的制备方法，是以NaOH溶液对山杏核壳粉末进行超声提取，粗提液酸沉降后依次以纤维素酶和糖化酶酶解，碱溶后再次酸沉降，加热酸解后反复进行碱溶和酸沉降，得到黑色素纯品，溶于NaOH溶液中，经超声处理和超声波细胞破碎机破碎，酸沉降得到黑色素纳米颗粒，最后以mPEG2000-NH2修饰处理，得到水溶性黑色素纳米颗粒。虽然该方法制备的黑色素纳米颗粒粒径均一，具有良好的水溶性和分散稳定性，但其提取过程过于繁琐，不仅需要消耗大量的溶剂，而且原料的使用量巨大。肿瘤细胞具有无限增殖的特点。因此，从黑色素瘤细胞中提取黑色素，能够源源不断地获得黑色素产物。从黑色素瘤细胞中提取黑色素的方法尚未报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从黑色素瘤细胞中提取黑色素的方法，以期工艺简单、绿色、可再生地提取制备水溶性黑色素纳米粒子。本专利技术所述的从黑色素瘤细胞中提取黑色素的方法是收集体外培养黑色素瘤细胞的细胞培养液，离心除去沉淀物，得到含有黑色素粗品的溶液，再通过膜裂解的方式对含有黑色素粗品的溶液进行处理，并纯化后，干燥得到水溶性良好的黑色素纳米粒子。其中，所述的膜裂解的方式可以是化学裂解、酶裂解、机械裂解中的任意一种，或几种的组合。收集到的体外培养黑色素瘤细胞的细胞培养液中主要含有死细胞碎片等杂质，通过采用低速离心的方式可以将其除去。但是，除去杂质后的上清液中仍然存在有黑色素瘤细胞分泌的囊泡、外泌体等，通过膜裂解的方式破坏囊泡膜结构，再进行纯化，清除掉除黑色素之外的其他内容物，即可获得水溶性良好的黑色素纳米粒子。本专利技术所述方法中，所述的黑色素瘤细胞优选使用B16系黑色素瘤细胞，包括但不限于是B16F0、B16F10等各种鼠源黑色素瘤细胞。进一步地，所述的细胞培养液是各种适合黑色素瘤细胞培养的基础培养基，包括但不限于是DMEM高糖培养基、DMEM低糖培养基、IMDM培养基、PRMI1640培养基等各种基础培养基。更进一步地，本专利技术还在所述基础培养基中添加有必要的血清和/或抗生素，以组成完全培养基。例如，可以添加有10%FBS，以及添加1%青霉素和链霉素。优选地，本专利技术使用DMEM高糖培养基。在相同的培养条件下，使用DMEM高糖培养基培养黑色素瘤细胞，其分泌黑色素的能力更强。本专利技术所述方法中，收集黑色素瘤细胞培养液的时间应该是在细胞完全贴壁后。更具体地，可以在铺板12～24小时后，观察培养基颜色为黑棕色时进行收集。具体可以根据黑色素瘤细胞的生长状态以及黑色素瘤细胞分泌黑色素的状态选择收集培养基的时间。本专利技术所述方法中，具体是将收集的体外培养黑色素瘤细胞的细胞培养液通过低速离心的方式除去细胞碎片等杂质，并收集上清液，得到含有黑色素粗品的溶液。更进一步地，所述低速离心的转速优选为800～1500rpm，离心时间为5～20min。通过化学裂解可以溶解细胞或抽提胞内组分，本专利技术进行化学裂解所采用的化学裂解液包括但不限于是酸、碱、表面活性剂、复合配方裂解液或有机溶剂等各种常规的化学裂解液。所述的机械裂解可以包括热休克或超声波处理。其中，所述热休克是通过反复冷冻和解冻的方式，将含有黑色素粗品的溶液在液氮或-20℃以下进行冷冻，室温中解冻，反复几次以达到裂解细胞、破坏膜结构的效果。所述超声波处理是采用超声波细胞破碎仪的探头处理含有黑色素粗品的溶液，利用超声空化作用将细胞破碎。优选地，所述超声波处理的超声功率为150～1000W，超声处理时间3～120S即可。进一步地，本专利技术可以采用超滤离心或透析的方法，对膜裂解处理后的溶液进行纯化处理。具体地，所述超滤离心使用截留分子量为3～100kDa的超滤膜，控制离心转速6000±2000rpm，离心时间10～30min。所述透析处理使用截留分子量在3～100kDa的透析袋。进一步地，本专利技术干燥得到黑色素纳米粒子的方式可以包括但不限于是冷冻干燥、鼓风干燥、真空干燥等任意一种方法。本专利技术的黑色素提取方法采用了废物利用策略，利用原料——黑色素瘤细胞可以无限增殖的特点，通过简单无污染的处理方式，无需额外化学试剂，即可直接制备得到水溶性良好的小尺寸黑色素纳米粒子，是一种绿色、可再生、工艺简单的提取水溶性黑色素纳米粒子的方法。细胞具有可以无限传代而不凋亡的特点，本专利技术从黑色素瘤细胞中提取水溶性黑色素纳米粒子，能够源源不断地从收集得到的废弃细胞培养液中获得黑色素产物，不仅废物利用、绿色处理，而且可以无限制备黑色素纳米粒子。采用本专利技术方法制备的黑色素纳米粒子克服了现有黑色素水溶性差、粒径尺寸大的问题，不仅具有良好的水溶性，而且粒径尺寸不大于10nm，与人体具有良好的生物组织相容性，用于药物或药物载体时，对机体产生的生物毒性低，且可以通过肾脏代谢的方式排出体外，在临床、科研应用中具有广阔的应用前景和经济、社会意义。附图说明图1是实施例1制备水溶性黑色素纳米粒子的溶液实物图。图2是实施例1制备黑色素粗品的透射电子显微镜图。图3是实施例1制备水溶性黑色素纳米粒子的透射电子显微镜图。图4是实施例1制备水溶性黑色素纳米粒子的高分辨透射电子显微镜图。图5是实施例1制备水溶性黑色素纳米粒子的粒径分布图。图6是实施例1制备水溶性黑色素纳米粒子的Zeta电位图。图7是实施例1制备水溶性黑色素纳米粒子的紫外-可见光吸收光谱图。图8是实施例1制备水溶性黑色素纳米粒子的红外光谱图。图9是实施例1制备水溶性黑色素纳米粒子的细胞毒性图。图10是实施例2制备水溶性黑色素纳米粒子的粒径分布图。图11是实施例3制备水溶性黑色素纳米粒子的粒径分布图。图12是实施例4制备黑色素纳米粒子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从黑色素瘤细胞中提取黑色素的方法，是收集体外培养黑色素瘤细胞的细胞培养液，离心除去沉淀物，得到含有黑色素粗品的溶液，再通过膜裂解的方式对含有黑色素粗品的溶液进行处理，并经超滤离心或透析纯化后，干燥得到水溶性良好的黑色素纳米粒子。/n

【技术特征摘要】
1.一种从黑色素瘤细胞中提取黑色素的方法，是收集体外培养黑色素瘤细胞的细胞培养液，离心除去沉淀物，得到含有黑色素粗品的溶液，再通过膜裂解的方式对含有黑色素粗品的溶液进行处理，并经超滤离心或透析纯化后，干燥得到水溶性良好的黑色素纳米粒子。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征是膜裂解的方式是化学裂解、酶裂解、机械裂解中的任意一种，或几种的组合。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的黑色素瘤细胞为B16系黑色素瘤细胞。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征是所述的黑色素瘤细胞为鼠源黑色素瘤细胞B16F0或B16F10。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征是在细胞完全贴壁...

【专利技术属性】
技术研发人员：李利平，张瑞平，许玮月，陈艺尤，白佩蓉，刘妍，
申请(专利权)人：山西医科大学，山西白求恩医院山西医学科学院，
类型：发明
国别省市：山西;14