可特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的多肽分子及制备方法技术

本发明专利技术提供了一种可特异性结合新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS‑CoV‑2)核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N蛋白)的多肽分子及制备方法，涉及生物技术领域，该多肽分子的氨基酸序列为MQPMNALGGGAY。本发明专利技术采用优化的液相亲和淘选方式，快速淘选获得可特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的多肽分子，所述的多肽分子与具传统的抗体相比，具有优良的特异性，更好的酸碱耐受及热稳定性，该多肽分子的获得无需免疫过程、制备简单、成本低、周期短，该多肽分子既可通过生物培养的方式大量扩增，也可以通过化学合成或者基因工程的方法进行大量制备，为新型冠状病毒核衣壳蛋白特异性识别元件的制备提供了新的路径，具有较好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
可特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的多肽分子及制备方法
本专利技术涉及生物
，特别是涉及可特异性结合新型冠状病毒(SevereAcuteRespiratorySyndromeCoronavirus2,SARS-CoV-2)核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein,N蛋白)的多肽分子及制备方法。
技术介绍
现有研究已证实，新型冠状病毒肺炎(Coronavirusdisease2019,COVID-19)是由新型冠状病毒(SevereAcuteRespiratorySyndromeCoronavirus2,SARS-CoV-2)所导致。研究表明，新型冠状病毒为正链单链RNA病毒，基因组长约30Kb，两端为非编码区，中间为非结构蛋白编码区和结构蛋白编码区。非结构蛋白编码区主要包括开放读码框ORF1a和ORF1b基因，编码16个非结构蛋白。结构蛋白编码区主要编码刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白。核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein,N蛋白)序列保守程度高，在病毒复制过程中发挥重要作用。N蛋白与病毒RNA结合形成复合体，随后在膜蛋白和包膜蛋白的共同作用下，包裹后进入病毒衣壳中。N蛋白是SARS-CoV-2含量最丰富的蛋白，能刺激机体产生高亲和力的抗体。N蛋白可作为检测抗原，用于COVID-19患者的血清抗体检测。同理，检测SARS-CoV-2病毒裂解后释放出的N蛋白，也可作为判断SARS-CoV-2病毒是否存在的一个依据。现有技术未发现有关于可特异性结合新型冠状病毒(SevereAcuteRespiratorySyndromeCoronavirus2,SARS-CoV-2)核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein,N蛋白)的多肽分子的报导。
技术实现思路
本专利技术以新型冠状病毒核衣壳蛋白为靶分子，将靶分子结合到酶标板载体上，投入噬菌体随机展示十二肽库，通过优化的亲和淘选条件，获得了一种可特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的多肽分子，其氨基酸序列为：M-Q-P-M-N-A-L-G-G-G-A-Y。上述多肽分子结构中，大写英文字母分别代表已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种，即M代表甲硫氨酸(蛋氨酸)残基，Q代表谷氨酰胺残基，P代表脯氨酸残基，N代表天冬酰胺残基，A代表丙氨酸残基，L代表亮氨酸残基，G代表甘氨酸残基，Y代表酪氨酸残基。本专利技术还涉及编码上述多肽分子氨基酸序列(MQPMNALGGGAY)的核苷酸，其序列为:ATGCAGCCTATGAATGCTTTGGGTGGTGGTGCTTAT。本专利技术提及多肽分子可通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有多肽分子的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有多肽分子的噬菌体粒子。化学合成是指依据公布的多肽氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成。基因工程重组表达的方式是指将编码多肽分子的基因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行多肽分子的大量制备。本专利技术的有益效果是：本专利技术所提及的多肽分子可替代传统的新型冠状病毒核衣壳蛋白抗体分子，该多肽分子具有特异性强、结构稳定性好、耐酸碱、耐高温，制备简单、快速等特点。此外，本专利技术通过噬菌体展示多肽库技术，采用亲和淘选的方式，从噬菌体展示多肽库中快速筛选到能与新型冠状病毒核衣壳蛋白特异性结合的多肽分子，其可作为核衣壳蛋白的多克隆抗体、单克隆抗体等传统抗体的替代物。该方法避免了制备传统单克隆抗体所需要的动物免疫、细胞融合、单克隆筛选等流程，具有无需免疫过程、筛选方便、周期短、制备成本低等特点。附图说明图1为ELISA鉴定多肽分子与SARS-CoV-2核衣壳蛋白的结合特性图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的若干实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容更加透彻全面。实施例1与新型冠状病毒核衣壳蛋白特异性结合多肽分子的亲和淘选及其鉴定1)亲和淘选与SARS-Cov-2核衣壳蛋白特异性结合多肽分子的具体方法为：取0.1mgSARS-Cov-2核衣壳蛋白(氨基酸序列见genebank：MN908947.3)，包被于酶标板孔(150μL/孔)，4℃孵育12小时。取出酶标板，用PBST(10mMPBSpH7.4包含0.5％Tween-20(v/v))洗涤10次后，加入350μl封闭液(5％明胶溶液)37℃孵育2小时，用PBST洗涤10次后加入100μl噬菌体肽库(噬菌体展示随机十二肽库，购自NEB公司，用PBS10倍稀释噬菌体原液，约2.0×1011pfu)，37℃振荡反应60min。2)用PBST洗涤15次，去除未结合的噬菌体，随后加入洗脱液(Gly-HCL，pH2.2)100μL，16-22℃下轻摇震荡10min以洗脱与核衣壳蛋白结合的噬菌体。吸出洗脱液，加入15μL、1MTris-HCl(pH9.1)中和缓冲液。取10μl中和液进行噬菌体滴度测定，其余的用于感染20mL生长至对数前期的E.coliER2738菌株进行扩增。第二天用PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体，并测定扩增后噬菌体的滴度。然后依次进行第2轮和第3轮淘选，淘选步骤与第一轮大体相同，每次加入的噬菌体量均为2×1011pfu，不同之处在于：第2、3轮筛选的噬菌体展示多肽与包被了SARS-Cov-2核衣壳蛋白的板条孵育时间分别为60min、30min；SARS-Cov-2核衣壳蛋白的包被浓度分别为50、25μg，竞争洗脱液的洗脱时间分别为5min、3min。3)阳性噬菌体克隆的鉴定：从第3轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑取100个噬菌体斑，进行噬菌体的扩增，采用酶联免疫吸附检测方法进行阳性噬菌体克隆的鉴定，具体方法为：首先，用10mMPBS(pH7.4)稀释新型冠状病毒核衣壳蛋白，1μg/mL包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST(10mMPBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有3％脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时；投入100μl噬菌体斑扩增液(1.0×1012pfu)，以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37℃孵育1小时；加入1：5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100μl，37℃孵育1小时；加入100μlTMB底物液，避光显色5min，酶标仪读取450nm处的吸收值。选取OD450大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆。4)特异性结合SARS-CoV-2核衣壳蛋白多肽分子的鉴定：采用ELISA的方法进行多肽分子与SARS-Cov-2核衣壳蛋白结合能力及特异性的鉴定，具体方法为：用10mMPBS(pH7.4)分别包被SARS-Cov-2核衣壳蛋白、SARS核衣壳蛋白(氨基酸序列见genebank：AY274119.3)(100μL/孔，1μg/ml)、健康人血清(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的多肽分子，其特征在于，该多肽分子的氨基酸序列为:M-Q-P-M-N-A-L-G-G-G-A-Y。/n

【技术特征摘要】
1.一种可特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的多肽分子，其特征在于，该多肽分子的氨基酸序列为:M-Q-P-M-N-A-L-G-G-G-A-Y。


2.编码权利要求1所述的氨基酸序列的核苷酸。


3.如权利要求2所述的核苷酸的序列对应为:
ATGCAGCCTATGAATGCTTTGGGTGGTGGTGCTTAT。


4.权利要求1所述的可特异性结合新型冠状病毒核...

【专利技术属性】
技术研发人员：万蒙，何庆华，
申请(专利权)人：江西乐成生物医疗有限公司，
类型：发明
国别省市：江西;36