一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗及其制备方法。本发明专利技术针对变异毒株，将SBDS‑GPV JS01株VP2基因进行密码子优化，克隆至杆状病毒载体，成功构建重组杆状病毒rBac‑JS01VP2株；采用昆虫细胞全悬浮(或转瓶)培养，技术成熟、便于转产和逐级放大培养；与传统鸭胚或鸭胚成纤维细胞培养相比，毒价高、质量稳定、生产周期短、成本低；与抗体产品相比，保护率高、母源抗体持续时间长，仅免疫母鸭，节约劳动力和成本；无血清或蛋源杂蛋白，副反应极低；表达的VP2蛋白可组装成病毒样颗粒(VLPs)，免疫原性好；表达量高(病毒滴度为8.0Log

【技术实现步骤摘要】
一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗及其制备方法
本专利技术涉及一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
鹅细小病毒病(gooseparvovirus,GPV)，又称Derzsy氏病，俗称小鹅瘟、鹅肠炎等，是一种侵害幼鹅和番鸭的一种高度接触传染性疾病，病名的多样性反映了该病多个病理学特征是危害多品种水禽的一种病毒性传染病。早在1956年，方定一先生率先在江苏省扬州市发病鹅群中发现并鉴定GPV，随后该病在世界范围内蔓延，但番鸭极少发病。鸭短喙侏儒综合征病毒(SBDSV)又称为新型小鹅瘟病毒(novelgooseparvovirus,NGPV)或短喙型小鹅瘟病毒(gooseparvovirusvariants)，临床感染症状以生长发育受阻、跛行瘫痪、上下喙萎缩及舌头外露为主要特点。法国学者在20世纪70年代首先报道SBDS，随后我国台湾地区(1990年前后)和波兰(1997年)也相继报道该病。2009年，匈牙利学者通过对法国半番鸭SBDS病例中病毒的分离鉴定，明确病原为小鹅瘟病毒西欧分支。我国学者也对2014年以来引起我国的SBDS的病原进行系统鉴定，证实该病是由一种新型小鹅瘟病毒。该病主要发生于1～3周龄的雏鹅、雏鸭和雏番鸭，尤其是1周龄左右的更易感，4周龄以上的鹅或鸭感染后，很少表现临床症状。由于该病可引起感染鸭出现长舌短喙及生长障碍为特征的临床症状，故也将此小鹅瘟病毒变异毒株命名为短喙型小鹅瘟病毒(SBDS-GPV)或鸭短喙侏儒综合征病毒(SBDSV)。2014年下半年以来，SBDS在我国福建、江苏、山东、安徽、河南与四川等地区半番鸭和樱桃谷鸭养殖场暴发流行。该病发病率10％～100％不等，死亡率低于10％，但僵鸭或残鸭率高达20％～80％，该病的流行对我国的养鸭业造成了巨大的经济损失。由于病毒变异导致目前使用的小鹅瘟疫苗或抗体制品无法有效防控该疫病在鸭中的流行，因此亟需开发针对变异毒株相关疫苗。本专利技术分离变异毒株，并将其VP2基因进行密码子优化，成功构建重组杆状病毒，制备鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗，旨在通过免疫种鸭，使雏鸭获得良好的被动免疫，既填补了针对变异株的防控空白，又解决了抗体产品存在的保护率低、劳动强度大、成本高、生物安全风险高和全病毒灭活疫苗存在的病毒培养难度大、副反应高等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗及其制备方法；所提供的疫苗具有高效、安全性好、保护率高的优点，以解决鸭短喙侏儒综合征的预防的需要。本专利技术的技术方案如下：1.一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗包含有序列1的灭活鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01VP2株病毒和疫苗佐剂，其所用的抗原为灭活的鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01VP2株病毒；所述鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01VP2株病毒，该病毒是根据测得的SBDS-GPVJS01株VP2基因序列，对VP2基因进行密码子优化，通过化学合成方法获得SEQIDNo.1所示优化后的VP2基因，以其为模板，将两端分别引入BamHI和XbaI酶切位点，扩增VP2基因；通过BamHI和XbaI双酶切后克隆至pFastBacHTA载体，获得重组质粒pFastBacHTA-JS01VP2；采用CellfectinⅡRegent转染试剂将重组质粒pFastBacHTA-JS01VP2转染至Sf9细胞进行重组病毒的拯救，获得1株重组病毒，命名为rBac-JS01VP2株；所述的鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01VP2株病毒感染Sf9或Sf+细胞均可成功表达可自我组装成病毒样颗粒(VLPs)的VP2蛋白。2.本专利技术所述一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗的制备方法包括：(1)重组杆状病毒扩增：将重组杆状病毒rBac-JS01VP2接入昆虫细胞Sf9进行转瓶培养或sf+进行悬浮培养，28±2℃培养5～7天，获得重组杆状病毒液，病毒滴度不低于7.6LogTCID50/ml；(2)灭活：将病毒液加入灭活罐中，将温度平衡至37±2℃，加入活化的BEI，使得BEI终浓度为0.2％～0.3％，将pH值控制在7.5±0.3，搅拌2～4h后，将内容物转移到另一个容器中，可加入消泡剂，以防止起泡。维持37±2℃继续灭活，总灭活时间为24h。灭活结束后，37±2℃下加入20％(w/v)硫代硫酸钠，使其终浓度为0.5％～1.5％，将pH值控制在7.5±0.2，搅拌1h；(3)抗原纯化：通过离心或过滤去除细胞碎片和其它颗粒物，可进一步使用0.01MPBS对上清液透析，以减少培养基组分和其他小分子物质的含量；(4)配苗：将油相(94份白油、6份司本-80、2份硬脂酸铝)和水相(96份灭活抗原液、4份吐温-80)按3:2混合经乳化而成。3.本专利技术所述一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗，其特征在于，该疫苗成品效力检验中可采用ELISA抗体检测方法(间接ELISA)测定免疫动物抗体效价和/或攻毒试验结果。附图说明图1SBDS-GPVJS01株P5代次病毒接种鸭胚6日后胚体的出血性变化图中：A:接种PBS对照鸭胚；B:SBDS-GPVJS01株P5代次病毒感染鸭胚，6日后鸭胚死亡(白色箭头指示胚体出血)。图2SBDS-GPVJS01株VP1基因进化分析图32日龄GPV阴性健康鸭人工感染SBDS-GPVJS01株后的体重和喙长变化图4间接免疫荧光法检测重组VP2蛋白的表达图中：A:感染重组病毒的Sf9细胞；B:正常Sf9细胞对照图5重组VP2蛋白表达的蛋白质免疫印迹分析图中：M:PageRulerPlus预染蛋白分子量标准；第1泳道和第2泳道分别代表细胞培养上清与细胞沉淀图6电镜观察VP2蛋白自我组装成的VLPs本专利技术涉及的微生物资源信息本专利技术涉及的微生物资源是从江苏地区某疑似SBDS发病樱桃谷肉鸭场中分离获得SBDS-GPVJS01毒株(中国兽医科学。2020,50(10):1286-1293)，该毒株具有较广的宿主感染谱。本专利技术人对SBDS-GPVJS01株VP2基因进行密码子优化，将优化的VP2基因(序列1)克隆至杆状病毒载体，成功构建了被命名为鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01VP2株(简称rBac-JS01VP2株)病毒。专利技术新的技术效果本专利技术涉及一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗及其制备方法。本专利技术采用昆虫细胞全悬浮(或转瓶)培养技术成熟、便于转产和逐级放大培养；与传统鸭胚或鸭胚成纤维细胞培养相比，毒价高(悬浮培养毒价为8.2～8.5Log10TCID50/mL，转瓶培养毒价为7.8～8.0Log10TCID50/ml)、质量稳定、生产周期短、成本低；与抗体产品相比，保护率高、母源抗体持续时间长，仅免疫母鸭本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗包含有序列1的灭活鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01 VP2株病毒和疫苗佐剂，其所用的抗原为灭活的鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01 VP2株病毒；/n所述鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01 VP2株病毒，该病毒是根据测得的SBDS-GPV JS01株VP2基因序列，对VP2基因进行密码子优化，通过化学合成方法获得SEQID No.1所示优化后的VP2基因，以其为模板，将两端分别引入BamH I和Xba I酶切位点，扩增VP2基因；通过BamH I和Xba I双酶切后克隆至pFastBac HTA载体，获得重组质粒pFastBac HTA-JS01VP2；采用CellfectinⅡRegent转染试剂将重组质粒pFastBac HTA-JS01VP2转染至Sf9细胞进行重组病毒的拯救，获得1株重组病毒，命名为rBac-JS01 VP2株；/n所述的鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01 VP2株病毒感染Sf9或Sf+细胞均可成功表达可自我组装成病毒样颗粒(VLPs)的VP2蛋白。/n...

【技术特征摘要】
1.一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗包含有序列1的灭活鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01VP2株病毒和疫苗佐剂，其所用的抗原为灭活的鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01VP2株病毒；
所述鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01VP2株病毒，该病毒是根据测得的SBDS-GPVJS01株VP2基因序列，对VP2基因进行密码子优化，通过化学合成方法获得SEQIDNo.1所示优化后的VP2基因，以其为模板，将两端分别引入BamHI和XbaI酶切位点，扩增VP2基因；通过BamHI和XbaI双酶切后克隆至pFastBacHTA载体，获得重组质粒pFastBacHTA-JS01VP2；采用CellfectinⅡRegent转染试剂将重组质粒pFastBacHTA-JS01VP2转染至Sf9细胞进行重组病毒的拯救，获得1株重组病毒，命名为rBac-JS01VP2株；
所述的鸭短喙侏儒综合征病毒重组杆状病毒rBac-JS01VP2株病毒感染Sf9或Sf+细胞均可成功表达可自我组装成病毒样颗粒(VLPs)的VP2蛋白。


2.如权利要求1所述一种鸭短喙侏儒综合征基因工程亚单位灭活疫苗的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：田红，荣先锋，孙雅鑫，
申请(专利权)人：北京维牧康动保生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11