一种1型糖尿病新动物模型的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种1型糖尿病新动物模型的构建方法，通过诱导胰岛细胞损伤结合条件性敲除调节性T细胞来构建1型糖尿病模型，解决了普通NOD小鼠糖尿病模型与人糖尿病临床症状之间的差异问题，构建出了一个新的且更加接近人类1型糖尿病发病状态的动物模型。本发明专利技术提供的小鼠糖尿病模型构建简便，与人类1型糖尿病的临床特点一致性较高，具有较强的实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种1型糖尿病新动物模型的构建方法
本专利技术属于糖尿病动物模型制备领域，具体涉及一种1型糖尿病新动物模型的构建方法。
技术介绍
1型糖尿病(T1D)又名胰岛素依赖型糖尿病(InsulinDependentDiabetesMellitus，IDDM)是由于自身反应T细胞攻击分泌胰岛素的胰岛β细胞而引起的自身免疫疾病。一旦β细胞功能受损，胰岛素的分泌受阻，血糖无法控制在正常水平就会诱发酮酸中毒和严重高血糖，还会诱发失明和晚期肾病等严重并发症。在环境和易感基因的共同作用下，1型糖尿病患者机体出现明显的免疫异常。控制免疫平衡的调节性T细胞数量或功能失常，导致机体向炎症方向发展。早期的CD8+T细胞识别胰岛β细胞表面的MHC-I后开始杀伤胰岛β细胞，释放胰岛抗原。树突状细胞，巨噬细胞和它们的前体单核细胞递呈抗原给胰腺淋巴结中的T细胞。在这个过程中，由于胰岛抗原在内质网错误折叠形成新的抗原，或者T细胞在胸腺中逃离了阴性选择，造成接受自身胰岛抗原的T细胞被活化，自身免疫反应就此出现。化学药物诱发的动物模型中，最常用的诱导急性1型糖尿病的化学药物是四氧嘧啶(Alloxan，ALX)和链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，它们属于葡萄糖类似物通过GLUT2葡萄糖转运体预先在胰岛β细胞中积累。胞内存在硫醇的情况下，四氧嘧啶通过反应产物羟基自由基导致β细胞死亡，同时通过抑制葡萄糖激酶来阻止胰岛素的分泌。链脲佐菌素可直接烷基化β细胞DNA，或者损伤线粒体DNA来抑制β细胞的线粒体代谢，从而阻止胰岛素的分泌。但四氧嘧啶除了损伤胰岛，还可能造成其他器官的损伤。不同于1型糖尿病在低龄儿童青少年高发，年长的动物对四氧嘧啶毒性更难敏感。四氧嘧啶不稳定且半衰期很短，在37℃，pH7.4的磷酸盐缓冲液半衰期为1.5分钟，在水溶液中迅速分解为不致糖尿病的阿脲酸。研究表示阿脲酸或者四氧嘧啶其他的转化产物，能够损伤动物的肝组织。所以不稳定的四氧嘧啶更容易损伤其他器官。考虑到这些缺点，四氧嘧啶逐渐被链脲佐菌素所替代。链脲佐菌素诱导的是的糖尿病模型，有明显的胰岛炎。多次小剂量的链脲佐菌素能促进转基因小鼠局部淋巴细胞增殖以及加强β细胞表面T细胞共刺激分子CD80表达。最新的研究也表示高剂量的链脲佐菌素引起胰岛炎症是由于巨噬细胞吞噬坏死的β而完全不会激起适应性免疫。目前免疫细胞在链脲佐菌素诱导的糖尿病模型中的机制仍不清楚。给小鼠注射高剂量(150mg/kg)的链脲佐菌素能诱发急性的糖尿病，不引发任何并发症。与人1型糖尿病不同的是，这种急性的糖尿病不是免疫介导的，高剂量链脲佐菌素直接对β细胞产生毒性导致快速且严重的毒性糖尿病。即便根据调节链脲佐菌素剂量能够快速获得所需要的糖尿病模型，但是链脲佐菌素诱导的模型不稳定，容易受实验的动物种类，食物摄取量，实验动物起始体重等外在因素影响。例如：中国专利201910064657.7公开了一种Ⅰ型糖尿病动物模型的构建方法，选用C57BL/6小鼠首次尾静脉注射，而后连续5天腹腔注射50mg/kg·BW链脲佐菌素试剂，该方法造模简便、成模率高，但是只能满足1型糖尿病发病症状的部分特点(血糖提高)，未能考虑到发病症状免疫学上的一致。例如：中国专利201610741829.6公开了一种1型糖尿病动物模型的建立方法和用途，利用100mg/kg链脲佐菌素诱导的方法，建立了稳定的食蟹猴1型糖尿病模型，能完全诱导形成1型糖尿病且不引发并发症的发生。该专利技术不仅对血糖指标进行了评价，也对免疫水平进行了评价，但是该模型选用的动物食蟹猴在实际应用中成本较高，因此需要一种用途更广的动物模型。NOD(non-obesediabetic)小鼠是一种常用的1型糖尿病动物模型，原因在于其胸腺异常的结构导致胸腺细胞无法分泌自身抗原，使得T细胞在发育过程中无法阴性选择，这些自身反应的T细胞逃离到外周致病。其发病特征表现为多尿，多饮，糖尿高血糖伴随消瘦。雌鼠在2-4周出现胰岛炎症，雄性稍晚为5-7周。无菌环境中，30周龄雌鼠发病率为90％以上，而雄鼠为50％-80％。NOD小鼠早期高血糖和糖尿出现无需胰岛素治疗仍可存活数周。尽管NOD现在作为一个常用的1型糖尿病动物模型来研究人1型糖尿病的发病进程和治疗方法，但是它跟人的1型糖尿病之间有很多差异。组织学上显示发病的NOD小鼠胰岛中心有大量炎症细胞浸润而1型糖尿病患者胰岛中只检测到少量的白细胞。与1型糖尿病临床患者不同，NOD发病背景主要是CD4+T细胞介导，且长期发病NOD小鼠不发生酮尿症。尽管有越来越多的1型糖尿病动物模型被开发用于1型糖尿病发病机制的探讨，但是目前的动物模型与人1型糖尿病临床特点很难高度一致，尤其是广泛使用的NOD小鼠由于自然发病的特点，被广为应用于临床前治疗药物的药效评价。不幸的是，在小鼠有效的治疗药物在人体上并无显著效果，甚至加速疾病的发展。这些失败让研究者不断的思考是否NOD小鼠的发病机制与人差异很大。所以，迫切需要开发一个新的且更加接近人类1型糖尿病发病的状态的动物模型。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种1型糖尿病新动物模型的构建方法。本专利技术提供的构建方法针对原始动物进行诱导胰岛细胞损伤结合条件性敲除调节性T细胞(RegulatoryTcells，Tregs)来诱导1型糖尿病。其具体原理在于利用链脲佐菌素诱导胰岛β细胞损伤产生炎症，同时敲除调节性T细胞造成自身反应性T细胞进一步攻击胰岛β细胞，从而造成类似人类1型糖尿病相同的发病机制。本专利技术通过诱导胰岛细胞损伤和条件性敲除调节性T细胞完成1型糖尿病新动物模型构建。具体地，所述的原始动物包括但不限于原始小鼠。更具体地，所述的原始小鼠包括但不限于BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠。进一步具体地，所述的原始小鼠包括但不限于Foxp3-DTR-eGFP小鼠。具体地，所述的诱导胰岛细胞损伤包括但不限于注射胰岛细胞损伤诱导剂。进一步具体地，所述的胰岛细胞损伤诱导剂包括但不限于四氧嘧啶和/或链脲佐菌素。进一步优选为链脲佐菌素。进一步具体地，所述的链脲佐菌素的注射量为20-200mg/kg体重；优选为40-80mg/kg体重；进一步优选为50mg/kg体重。进一步具体地，所述的四氧嘧啶的注射量为50-500mg/kg体重；优选为80-250mg/kg体重；进一步优选为100-200mg/kg体重。在一些实施方案中，所述的胰岛细胞损伤诱导剂在上述剂量下连续注射1-5天，每天注射一次；优选为连续3-4天，每天注射一次；进一步优选为连续3天，每天注射一次。具体地，所述的条件性敲除调节性T细胞包括但不限于注射白喉毒素(DT)。优选地，所述的白喉毒素的注射量为0.001-0.1mg/kg体重；优选为0.005-0.05mg/kg体重；进一步优选为0.0125mg/kg体重。进一步具体地，所述的注射方法可以为腹腔注射。也可以为能够达到等同效果的其他注射方式。具体地，所述的诱导胰岛细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种1型糖尿病新动物模型的构建方法，其特征在于，所述的构建方法通过诱导胰岛细胞损伤结合条件性敲除调节性T细胞来构建1型糖尿病模型。/n

【技术特征摘要】
1.一种1型糖尿病新动物模型的构建方法，其特征在于，所述的构建方法通过诱导胰岛细胞损伤结合条件性敲除调节性T细胞来构建1型糖尿病模型。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的诱导胰岛细胞损伤和条件性敲除调节性T细胞可以同步进行，也可以先后进行。


3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的诱导胰岛细胞损伤的方法为注射胰岛细胞损伤诱导剂；所述的条件性敲除调节性T细胞的方法为注射白喉毒素。


4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的胰岛细胞损伤诱导剂为四氧嘧啶、链脲佐菌素中的一种或多种。


5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的白喉毒素的注射量为0.001-0.1mg/kg体重。


6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述链脲佐菌素的注射量为20-200mg/kg体重。


7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵干，何忠淮，张世杰，丁媛，许永鹏，睢诚，程鑫，彭海长，俞庆龄，
申请(专利权)人：艾棣维欣苏州生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32