一种高产核酸片段的制备方法技术

本发明专利技术适用于生物技术领域，提供了一种高产核酸片段的制备方法，该制备方法包括以下步骤：在目标基因序列的5

【技术实现步骤摘要】
一种高产核酸片段的制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种高产核酸片段的制备方法。

技术介绍

[0002]核酸片段的制备主要通过合成、PCR扩增方法及通过质粒扩增后酶切获取，其中PCR方法因体外聚合酶识别、添加、切割过程中的低概率的突变的存在难以保证批间的均一性，而从质粒中酶切获取核酸片段由于细胞内复杂的复制机制可以有效保证基因序列的稳定，限制性内切酶又是专一性切割，保证了目标核酸片段的批间一致性。因此，通常更倾向于采用质粒酶切方式获取大量质量均一的目标核酸片段。
[0003]在核酸片段的制备过程中，先通过PCR扩增或者全序列合成获得目标核酸片段，将其插入到质粒载体中获得重组质粒，通过重组质粒的扩增与酶切，最终获取大量的目标核酸片段。通常重组质粒中只含有一个Copy的目标核酸片段，在目标核酸片段需求量比较低时，低收率的目标核酸片段亦能满足需求，但当需求量比较大时，目标核酸片段产量较低问题就变得异常突出，物料需求增多，生产周期延长，直接导致经济效益的低下。因此如何提高单位质粒中目标核酸片段的含量成为提高经济效益亟需解决的一大问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术实施例的目的在于提供一种高产核酸片段的制备方法，旨在解决
技术介绍
中提出的问题。
[0005]本专利技术实施例是这样实现的，一种高产核酸片段的制备方法，其包括以下步骤：
[0006]在目标基因序列的5
′
和3
′
端分别引入同一个限制性内切酶的识别位点，以便经单一酶切获取目的基因片段，并保证片段的均一性；
[0007]利用酶切、连接方式将目的基因片段与载体骨架连接成一种含有至少2Copy的目的基因片段的重组质粒。
[0008]扩增并收集重组质粒，利用单一限制性内切酶酶切重组质粒，得到酶切液；
[0009]将酶切液利用AKTA经阴离子交换树脂分离纯化，收集目的基因片段。
[0010]作为本专利技术实施例的另一种优选方案，所述步骤中，引入的限制性内切酶的识别位点为同一个酶。
[0011]作为本专利技术实施例的另一种优选方案，所述步骤中，重组质粒含有2～10个Copy的目的基因片段。
[0012]作为本专利技术实施例的另一种优选方案，所述步骤中，重组质粒含有2～3个Copy的目的基因片段。
[0013]作为本专利技术实施例的另一种优选方案，所述步骤中，目的基因片段的获取是通过直接酶切或者PCR与酶切相结合方法获取含有目的基因片段的酶切产物，经电泳分离、回收和纯化处理，得到目的基因片段。
[0014]作为本专利技术实施例的另一种优选方案，所述步骤中，载体骨架为去磷酸化载体骨
架片段，其是通过直接酶切或者PCR与酶切相结合方法获取含有ORI区和抗生素抗性基因区的载体骨架片段的酶切产物，经电泳分离、回收和纯化处理，得到载体骨架片段；然后将载体骨架片段进行去磷酸化处理后，再经纯化回收，得到去磷酸化载体骨架片段。
[0015]作为本专利技术实施例的另一种优选方案，所述抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因，以避免抗生素残留及抗性基因向环境的扩散。
[0016]本专利技术实施例提供的一种高产核酸片段的制备方法，其首先根据“质量源于设计”的理念，从质粒层面着手，增加质粒中目标基因片段的含量，进而提高单位发酵液中质粒的含量，提高了单一批次的目标基因片段的产量。
[0017]其中，目的基因的掺入方式可以是不同的酶切位点插入，可以是同一酶切位点串联后插入，可以是同尾酶酶切、串联后插入，也可以是混合形式。
[0018]根据设计，可通过直接酶切或者PCR与酶切相结合方法分别获取目的基因片段与载体骨架片段。
[0019]根据设计，目的基因片段或其自连接片段与去磷酸化载体骨架片段连接，并转化，经抗性筛选获取含有多个Copy目的基因片段的重组质粒。
[0020]其中目的基因的自连接片段是将目的基因片段与连接酶反应，自发的连接在一起，然后经琼脂糖凝胶电泳后，再进行切胶回收和纯化处理，得到目的基因自连接片段。
[0021]另外，扩增并收集重组质粒，利用单一限制性内切酶酶切，即可将多个目的基因片段从重组质粒中切割下来。然后将酶切液利用AKTA进行上样分析，经阴离子交换树脂分离纯化，收集目的峰及载体峰，分析峰面积及检测测定样品中目的基因片段的含量和载体的含量。该方法酶切操作简便，单一批次质粒样品中目的基因片段的产量高，样品中载体片段的含量低降低了其对目的基因片段分离的影响，样品中目的基因片段的含量高易于分离及提高纯度。
[0022]本专利技术提供了一种依据所述的核酸片段制备方法的一种实施例：构建含有两个拷贝目的基因片段的重组质粒，并制备目的基因片段，以验证其可行性，通过实施例可制得含有2copy及以上的目的基因片段的重组质粒，且不影响整体质粒拷贝数，提高了单一批次菌体获得的质粒产量，增大了单一批次纯化工作中所得目的基因片段的产量，实现了单一批次质粒样品中目的基因片段的高产出，缩短了生产周期，提高了设备利用率，增加了经济效益。
附图说明
[0023]图1为质粒pUC57
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Kan
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Yh酶切图谱；其中，M：DNA Marker；1：质粒pUC57
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Kan
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Yh的KpnI酶切。
[0024]图2为回收的Yh自连片段电泳检测图谱；其中，M：DNA Marker；1：Yh自连片段。
[0025]图3为重组质粒的鉴定结果图；其中，M：DNA Marker；A中1～5为质粒电泳检测；B中1～5为质粒NdeI酶切电泳检测；C中1～5为质粒KpnI酶切电泳检测。
[0026]图4为不同质粒菌株的质粒产量及目的基因片段产量分析结果图，其中1～5分别为2Yh01、2Yh02、2Yh03、2Yh04、2Yh05。
[0027]图5为质粒产量及目的基因片段产量对比分析结果图，其中2Yh01为重组质粒。
[0028]图6为重组质粒的结构图。
[0029]图7为纯化前酶切电泳检测图；其中，1为原质粒样；2为重组质粒样；M为DNA Marker。
[0030]图8为纯化后回收目的基因片段的电泳检测图；其中，M为DNA Marker；1为重组质粒样回收片段；2为原质粒样回收片段。
[0031]图9为重组质粒样制备片段的色谱谱图和色谱谱图积分结果图。其中，图9的(b)为图9的(a)中色谱谱图的局部放大图。
[0032]图10为原质粒样品制备片段的色谱谱图和色谱谱图积分结果图。其中，图10的(b)为图10的(a)中色谱谱图的局部放大图。
具体实施方式
[0033]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0034]该实施例提供了高产核酸片段制备的一种实施方法，其包括以下步骤：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产核酸片段的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在目标基因序列的5
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和3
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端分别引入同一个限制性内切酶的识别位点，以便经单一酶切获取目的基因片段，并保证片段的均一性；利用酶切、连接方式将目的基因片段与载体骨架连接成一种含有至少2Copy的目的基因片段的重组质粒；扩增并收集重组质粒，利用单一限制性内切酶酶切重组质粒，得到酶切液；将酶切液利用AKTA经阴离子交换树脂分离纯化，获得目的基因片段，并用HPLC检测目的基因片段的纯度。2.根据权利要求1所述的一种高产核酸片段的制备方法，其特征在于，所述步骤中，引入的限制性内切酶的识别位点为同一个酶。3.根据权利要求1所述的一种高产核酸片段的制备方法，其特征在于，所述步骤中，重组质粒含有2~10个Copy的目的基因片段。4.根据权利要求3所述的一种高产核酸片段的制备方法，其特征在于，所述步骤中，重组质粒含有2~3个Copy的目的基因片段。5.根据权利要求1所述的一种高产核酸片段的制备方法，其特征在于，所述步骤中，目的基因片段的获取是...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永正，马诗敏，张征立，李洋，康涛，
申请(专利权)人：江苏耀海生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：