一种提高酿酒酵母棕榈油酸含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高酿酒酵母棕榈油酸含量的方法。本发明专利技术提供了重组菌，为在产油脂酿酒酵母中进行如下1)的改造，得到的重组菌：1)提高所述产油脂酿酒酵母中OLE1基因的转录活性，得到的重组菌。本发明专利技术在产油较多的酿酒酵母菌株YS58中，过表达转录因子Mga2或截短的Mga2基因片段，提高调控Δ9去饱和酶的OLE1基因的表达水平，从而提高酿酒酵母棕榈油酸的含量，同时表达外源脂肪酸延长酶基因KCS与FAE，构建酿酒酵母基因工程菌，提高了酿酒酵母中棕榈油酸的含量。榈油酸的含量。

【技术实现步骤摘要】
一种提高酿酒酵母棕榈油酸含量的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种提高酿酒酵母棕榈油酸含量的方法。

技术介绍

[0002]棕榈油酸(palmitoleic acid)是一种16碳的单不饱和脂肪酸，双键位于碳端的第7个碳原子上(C16:1n
‑
7)。其具有广泛的医药和化妆品应用，对肥胖症、糖尿病、脂肪肝等慢性病具有一定的疗效，在降血糖、抗炎、改善皮肤色素沉着以及食品领域具有应用潜力。目前，鱼油等海产品是棕榈油酸的主要来源，但由于国际上禁捕鲸鱼和渔业资源匮乏，棕榈油酸来源受限。因此人们一直在努力扩大从微生物来源分离这种脂肪酸的可能性。
[0003]棕榈油酸作为生物代谢产物，主要以甘油三酯、磷脂或者甘油糖酯的形式存在。在酿酒酵母中，不饱和脂肪酸的形成是由于Δ9去饱和酶的作用，OLE1基因负责编码Δ9去饱和酶，转录因子Mga2通过控制OLE1基因的转录以及其mRNA的稳定性来调节不饱和脂肪酸的代谢。Mga2通过TM跨膜结构域的色氨酸残基可感知细胞膜上的不饱和脂肪酸的水平并结合配体，从而调节Mga2的转录活性，而膜上较高的不饱和脂肪酸水平导致Mga2的转录活化受到抑制，从而使脂肪酸脱氢酶的表达无法激活。而其IPT结构域、锚蛋白重复序列对不饱和脂肪酸合成的调控作用也尚未明确。
[0004]脂肪酸从头合成过程中C2到C4；C4到C16；C16到C18这三个阶段所用到的3
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酮酰基
‑
ACP合酶(KCS)是不同的。KCSIII负责将乙酰辅酶A和甲酰基辅酶A缩合成四碳单元，然后KCSI负责将四碳单元延伸到C16；最后一步KCSII负责C16到C18的延伸，其中C16和C18系脂肪酸是大部分动植物细胞脂肪酸组成的主要成分。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个目的是提供一种重组菌。
[0006]本专利技术提供的重组菌，为在产油脂酿酒酵母中进行如下1)的改造，得到的重组菌：
[0007]1)提高所述产油脂酿酒酵母中OLE1基因的转录活性，得到的重组菌。
[0008]上述重组菌中，所述提高产油脂酿酒酵母中OLE1基因的转录活性为提高所述产油脂酿酒酵母中OLE1基因的转录因子Mga2或其截短体的编码基因的表达量(过表达Mga2)；
[0009]所述转录因子Mga2的氨基酸序列为序列表中序列4；
[0010]所述转录因子Mga2截短体的氨基酸序列为序列表中序列4第1
‑
975位；
[0011]或所述转录因子Mga2截短体的氨基酸序列为序列表中序列4第1
‑
706位。
[0012]或所述转录因子Mga2或其截短体的编码基因的启动子为酿酒酵母强启动子，如PGK1或TEF1。
[0013]本专利技术Mga2过表达方法是将基因采用T4连接的方法克隆至YEplac112
‑
P
PGK
‑
T
CYC
载体上，并采用酿酒酵母强启动子PGK1启动表达。
[0014]上述重组菌中，所述重组菌为在在产油脂酿酒酵母中进行所述1)和如下2)的改造，得到的重组菌：
[0015]2)使所述产油脂酿酒酵母表达脂肪酸延伸酶。
[0016]上述KCS与FAE表达是采用T4连接以及无缝克隆的方法将基因序列克隆至pYES2.0载体，采用强启动子TEF1或PGK1启动表达，KCS的启动子为TEF1或PGK1，FAE的启动子为PGK1。
[0017]上述重组菌中，所述脂肪酸延伸酶为1种或2种；
[0018]所述脂肪酸延伸酶为来自于海甘蓝或碎米荠的脂肪酸延伸酶或与其氨基酸序列同源性大于95％的氨基酸残基的蛋白。
[0019]上述重组菌中，所述脂肪酸延伸酶为如下a)所示的脂肪酸延伸酶和b)所示的脂肪酸延伸酶：
[0020]a)所示的脂肪酸延伸酶为KCS；其编码基因来源于碎米荠(Cardaminehirsuta)的β
‑
酮酯酰辅酶A合酶基因，其核苷酸序列为序列表中序列2；
[0021]b)所示的脂肪酸延伸酶为FAE；其编码基因来源于海甘蓝(Crambe abyssinica)的β
‑
酮酯酰辅酶A合酶基因，其核苷酸序列为序列表中序列3。
[0022]上述重组菌中，所述产油脂酿酒酵母以酿酒酵母YS58为例。
[0023]本专利技术另一个目的是提供如下方法。
[0024]本专利技术提供制备第一个目的所述的重组菌的方法，为按照第一个目的中重组菌的改造形式制备。
[0025]上述重组菌在提高酿酒酵母的棕榈油酸含量中的应用也是本专利技术保护的范围；
[0026]或，上述重组菌在制备或生产棕榈油酸中的应用也是本专利技术保护的范围。
[0027]或，本专利技术提供了提高酿酒酵母棕榈油酸含量的方法，包括如下步骤：按照上述重组菌中的改进方式1)进行，实现提高酿酒酵母棕榈油酸含量；
[0028]或，本专利技术提供了提高酿酒酵母棕榈油酸含量的方法，包括如下步骤：按照上述重组菌中的改进方式1)和2)进行，实现提高酿酒酵母棕榈油酸含量。
[0029]本专利技术还有一个目的是提供一种制备或生产棕榈油酸的方法。
[0030]本专利技术提供的方法，包括如下步骤：
[0031]1)在YNB营养缺陷型培养基中发酵上述重组菌，收集发酵产物；
[0032]2)皂化法提取所述发酵产物中的脂肪酸，即得到棕榈油酸。
[0033]本专利技术所述酿酒酵母基因工程菌的构建方法是使用酿酒酵母基因转化试剂盒将载体化转入酿酒酵母，涂布在相应的营养缺陷型(Trp缺陷型或Ura缺陷型)固体培养基上，筛选成功转入重组载体的酿酒酵母基因工程菌。
[0034]本专利技术所述酿酒酵母基因工程菌的培养方法为：将工程菌接种至YNB培养基，在28℃，180rpm摇瓶连续活化两次。种子液接种至YNB营养缺陷型培养基28℃，180rpm摇瓶培养2天，18℃，180rpm继续培养4天之后，离心收集菌体。
[0035]本专利技术在产油较多的酿酒酵母菌株YS58中，过表达转录因子Mga2或截短的Mga2基因片段，提高调控Δ9去饱和酶的OLE1基因的表达水平，从而提高酿酒酵母棕榈油酸的含量，同时表达外源脂肪酸延长酶基因KCS与FAE，构建酿酒酵母基因工程菌，提高了酿酒酵母中棕榈油酸的含量。
[0036]本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术提高酿酒酵母中棕榈油酸含量，为突破棕榈油酸来源的局限性，扩展微生物来源提供参考。本专利技术以调控编码Δ9去饱和酶基因的转录
因子为出发点，构建酿酒酵母基因工程菌，可以有效提高OLE1基因的转录活性，利于不饱和脂肪酸的合成；同时转录因子与脂肪酸延长酶共同调控，有效提高酿酒酵母棕榈油酸含量，使酿酒酵母棕榈油酸含量达到60％。外源KCS类基因负责长链单不饱和脂肪酸的延伸，当细胞膜中不饱和脂肪酸过多时，棕榈油酸的合成会受到抑制，利用脂肪酸延长酶基因KCS与FA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组菌，为在产油脂酿酒酵母中进行如下1)的改造，得到的重组菌：1)提高所述产油脂酿酒酵母中OLE1基因的转录活性，得到的重组菌。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述提高产油脂酿酒酵母中OLE1基因的转录活性为提高所述产油脂酿酒酵母中OLE1基因的转录因子Mga2或其截短体的编码基因的表达量；所述转录因子Mga2的氨基酸序列为序列表中序列4；所述转录因子Mga2截短体的氨基酸序列为序列表中序列4第1
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975位；或所述转录因子Mga2截短体的氨基酸序列为序列表中序列4第1
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706位。3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为在在产油脂酿酒酵母中进行所述1)和如下2)的改造，得到的重组菌：2)使所述产油脂酿酒酵母表达脂肪酸延伸酶。4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述脂肪酸延伸酶为1种或2种；所述脂肪酸延伸酶为来自于海甘蓝或碎米荠的脂肪酸延伸酶或与其氨基酸序列同源性大于95％的氨基酸残基的蛋白。5.根据权利要求3或4所述的重组菌，其特征在于：所述脂肪酸延伸酶为如下a)所示的脂肪酸延伸酶；或，所述脂肪酸延伸酶为如下a)所示的脂肪酸延伸酶和b)所示的脂肪酸延伸酶：a)所示的脂肪酸延伸酶为由序列2所示的核...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘军锋，庞杰，邓利，王芳，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：