用于扩增水牛IL-2基因编码区引物及IL_2蛋白的原核表达方法技术

本发明专利技术提供的用于扩增水牛IL

【技术实现步骤摘要】
用于扩增水牛IL
‑
2基因编码区引物及IL_2蛋白的原核表达方法


[0001]本专利技术属于兽药生物
，具体涉及用于扩增水牛IL
‑
2基因编码区引物及IL_2蛋白的原核表达方法。

技术介绍

[0002]水牛白细胞介素
‑
2蛋白(IL
‑
2，以下简称“IL
‑
2”)，又名T细胞生长因子(Tcellgrowthfactor,TCRF)，由155个氨基酸组成，分子量大小为17.5KDa。IL
‑
2蛋白主要由T淋巴细胞在受到抗原物质或者是丝裂原刺激后合成并分泌；此外，B淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)及单核
‑
巨噬细胞也能够产生IL
‑
2。
[0003]研究表明，水牛IL
‑
2蛋白能促进T淋巴细胞的CD4+，CD8+增值，增强自然杀伤细胞(NK细胞)，单核细胞等的杀伤活性。水牛IL
‑
2蛋白作为免疫佐剂，与疫苗共同使用时能提高疫苗的免疫作用，如在牛支气管炎病毒和牛疱疹病毒疫苗免疫中起到很好的作用，能有效的预防和治疗奶牛乳房炎，在小鼠、牛体内使用重组IL
‑
2蛋白能增强对疱疹病毒的抵抗力，提高了抗病毒的作用。
[0004]而目前，国内对牛的IL
‑
2研究报道较多[13
‑
19]，而水牛IL
‑
2蛋白的研究停留在基因的克隆序列分析上[20
‑
>21]。水牛是南方重要的家畜，具有耐热，耐粗饲等特点，因为奶水牛的牛奶营养丰富，水牛的经济价值进一步提高，饲养规模增大，流行性疾病仍在盛行，其中牛病毒性腹泻病毒呈世界分布，感染后牛出现发热、腹泻、流产、死胎及畸形胎等症状，是影响牛产业发展的重要因素，新的疫苗药物研发是做好疾病防控的重要手段。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种水牛IL
‑
2蛋白及其原核表达方法，具体方案如下：
[0006]用于扩增水牛IL
‑
2基因编码区的引物，包含上游引物和下游引物，它们分别具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
[0007]进一步地，所述上游引物中具有BamH I酶切位点，下游引物中具有HindⅢ酶切位点。
[0008]如所述的用于扩增水牛IL
‑
2基因编码区的引物在PCR扩增中的应用。
[0009]进一步地，所述PCR扩增的反应程序为95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，34个循环；最后一次72℃延伸5min，获得扩增产物，所述扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，与pMD18
‑
T载体连接，构成克隆载体，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，双酶切鉴定。
[0010]一种水牛IL
‑
2蛋白的重组表达质粒Pet
‑
32a
‑
IL
‑
2。
[0011]进一步地，包括表达载体pET
‑
32a，所述表达载体pET
‑
32a和T
‑
IL
‑
2质粒通过HindⅢ和BamHI限制性内切酶于37℃双酶切6h，切胶回收酶切产物，将表达载体pET
‑
32a和水牛IL
‑
2蛋白编码区基因片段于16℃连接过夜。
[0012]一种含有所述重组表达质粒Pet
‑
32a
‑
IL
‑
2的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌。
[0013]一种所述的水牛IL
‑
2蛋白原核表达方法，包括如下步骤：
[0014](1)引物合成：根据水牛IL
‑
2蛋白基因编码区序列，采用Oligo 7.37进行引物设计，在其上游引物SEQ ID NO:1和下游引物SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中分别添加HindⅢ和BamHI限制性内切酶位点，抽取经ConA刺激的淋巴细胞总RNA，用于IL
‑
2基因编码区进行扩增，扩增产物与pMD18
‑
T载体连接，构成克隆载体，转化DH5α感受态细胞，得到T
‑
IL
‑
2质粒，并于
‑
20℃保存备用；
[0015](2)重组表达质粒Pet
‑
32a
‑
IL
‑
2的构建：将表达载体Pet
‑
32a与步骤(1)的T
‑
IL
‑
2质粒，通过HindⅢ和BamH I限制性内切酶于37℃双酶切6h，切胶回收酶切产物，将水牛IL
‑
2编码区基因片段和表达载体pET
‑
32a于16℃连接过夜，转入BL21感受细胞，经过PCR及测序验证，筛选插入阳性菌，得到重组表达质粒Pet
‑
32a
‑
IL
‑
2；
[0016](3)诱导表达：挑取步骤(2)的阳性菌于37℃摇床过夜培养作种子液，次日按1％接种量接种，培养4h后加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L进行诱导表达，在37℃继续诱导培养6h，离心收集菌体。
[0017]一种重组表达IL
‑
2蛋白的纯化方法，采用His标签蛋白纯化试剂进行纯化，其洗脱步骤如下：先用50mmol/L咪唑洗脱杂蛋白，220mmol/L咪唑洗脱目的蛋白，经过超滤分子筛浓缩目的蛋白，并把原来的buffer换成PBS。
[0018]所述的水牛IL
‑
2基因编码区的引物或所述的重组表达质粒Pet
‑
32a
‑
IL
‑
2在制备牛病毒性腹泻病毒药物或疫苗的应用。
[0019]本专利技术的优点
[0020]本专利技术以水牛IL
‑
2编码区基因片段为基础，构建了重组表达质粒pET
‑
32a
‑
IL
‑
2，将重组水牛IL
‑
2蛋白在大肠杆菌中可溶性高效表达，纯化后能与His标记抗体和山羊IL
‑
2多克隆体反应，且在牛肾细胞上能有效抑制牛病毒性腹泻病毒引起的细胞病变，具有很好的抗病毒效果。本专利技术为研发重组水牛IL
‑
2蛋白疫苗及研制治疗性生物剂奠定基础，对水牛养殖业的健康发展有重要的现实意义。
附图说明
[0021]图1为本专利技术的水牛IL
‑
2蛋白基因的PCR扩增产物电泳图结果。图中，采用M.DNA标准DL1 000；1：IL
‑
2基因扩增产物；2：阴性对照M.DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于扩增水牛IL
‑
2基因编码区的引物，其特征在于，包含上游引物和下游引物，它们分别具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的用于扩增水牛IL
‑
2基因编码区的引物，其特征在于，所述上游引物中具有BamH I酶切位点，下游引物中具有HindⅢ酶切位点。3.如权利要求1所述的用于扩增水牛IL
‑
2基因编码区的引物在PCR扩增中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，34个循环；最后一次72℃延伸5min，获得扩增产物，所述扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，与pMD18
‑
T载体连接，构成克隆载体，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，双酶切鉴定。5.一种水牛IL
‑
2蛋白的重组表达质粒Pet
‑
32a
‑
IL
‑
2。6.根据权利要求5所述的重组表达质粒Pet
‑
32a
‑
IL
‑
2，其特征在于，包括表达载体pET
‑
32a，所述表达载体pET
‑
32a和水牛IL
‑
2编码区基因片段，通过HindⅢ和BamHI限制性内切酶于37℃双酶切6h，切胶回收酶切产物，将表达载体pET
‑
32a和水牛IL
‑
2编码区基因片段于16℃连接过夜。7.一种含有权利要求5所述重组表达质粒Pet
‑
32a
‑
IL
‑
2的重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌。8.一种如权利要求5所述的水牛IL
‑
2蛋白的原核表达方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)引物合成：根据水牛IL
‑
2蛋白基因编码区序列，...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢芝勋，李小凤，范晴，谢志勤，谢丽基，李孟，罗思思，邓显文，黄娇玲，张艳芳，曾婷婷，王盛，张民秀，李丹，万丽军，韦悠，阮志华，任红玉，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：