一种甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A的多克隆抗体及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物化学技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A的多克隆抗体及其制备方法。本发明专利技术以甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A的DNA片段设计引物对BnTZF1A

【技术实现步骤摘要】
一种甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A的多克隆抗体及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物化学
，具体涉及一种甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A的多克隆抗体及其制备方法。

技术介绍

[0002]中国专利技术专利名称为“甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A及其引物、表达载体、应用和提高抗旱性的方法”(公开号为：CN110804614A)，公开了甘蓝型油菜中的BnaTZF1A基因，然后构建BnaTZF1A基因的过表达载体CaMV35S::BnaTZF1A并转化甘蓝型油菜XY15(湘油15)，在甘蓝型油菜中过表达BnaTZF1A基因，导致甘蓝型油菜抗旱性增强，但是现阶段缺少甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A蛋白相关的抗体。

技术实现思路

[0003]本专利技术目的是为了提供一种与甘蓝型油菜抗旱相关因子BnaTZF1A蛋白特异性结合反应的兔抗BnaTZF1A多克隆抗体及其制备方法。
[0004]本专利技术的技术方案如下：
[0005]一种甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0006](1)选择甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A中抗原性强的蛋白片段的核酸序列，设计引物对BnTZF1A
‑
RRF和BnTZF1A
‑
TZFR进行克隆，构建重组原核表达载体；
[0007](2)将步骤(1)中的重组原核表达载体转化表达细胞进行蛋白表达，得蛋白表达培养物；
[0008](3)将步骤(2)蛋白表达培养物进行纯化，将纯化得到的目标产物进行动物免疫诱导抗体产生，最后对抗体纯化即得甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A的多克隆抗体。
[0009]优选地，所述步骤(1)中编码核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010]优选地，所述步骤(1)中BnTZF1A
‑
RRF序列如SEQ ID NO:2所示，BnTZF1A
‑
TZFR序列如SEQ ID NO:3所示。
[0011]优选地，所述步骤(1)重组原核表达载体为pET28a
‑
SUMO
‑
JT载体。
[0012]优选地，所述步骤(2)表达细胞为Rosetta(DE3)。
[0013]优选地，所述步骤(3)蛋白表达培养物的纯化步骤为：用60ml预冷的NTA
‑
0缓冲液重悬蛋白表达培养物，超声破碎蛋白表达培养物，控制功率为300W，超声4s，暂停4s，超声99次；20000g4℃离心30min，分别收集上清和沉淀，用40μl 1X SDS
‑
PAGE上样缓冲液重悬，沸水浴5min后，取10ul进行蛋白电泳检测，剩余上清和沉淀于0
‑
7℃备用，电泳检测，用亲和层析树脂进行纯化。
[0014]一种甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A的多克隆抗体。
[0015]本专利技术选择甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A中抗原性强的蛋白片段的编码核酸序列，设计引物对BnTZF1A
‑
RRF和BnTZF1A
‑
TZFR进行克隆，构建重组原核表达载体，转化表达
细胞进行蛋白表达，得蛋白表达培养物，用蛋白表达培养物纯化后的目标产物进行动物免疫诱导抗体产生，最后对抗体纯化即得甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A的多克隆抗体，所得的甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A的多克隆抗体特异性高，通过WB质控。
附图说明
[0016]图1为蛋白小量表达结果图。
[0017]图2为蛋白大量表达后进行蛋白电泳检测图。
[0018]图3为抗体SDS
‑
PAGE电泳图。
[0019]图4为抗体验证WB图。
具体实施方式
[0020]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0021]实施例1甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A的克隆及其原核表达载体构建
[0022]通过生物信息学软件DNAStar分析获得的BnaTZF1A蛋白中抗原性强的蛋白片段的核酸序列SEQ ID NO:1，采用Primer 5.0软件设计上游引物对，构建原核表达载体，具体操作为：
[0023]A、以甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A的抗原性强的蛋白片段的核酸序列，设计引物对BnTZF1A
‑
RRF和BnTZF1A
‑
TZFR；其中BnaTZF1A的DNA片段如SEQ ID NO:1所示；BnTZF1A
‑
RRF序列如SEQ ID NO:2所示，BnTZF1A
‑
TZFR序列如SEQ ID NO:3所示；
[0024]B、PCR扩增，200ul体系，PCR扩增目的片段，产物回收。
[0025]200ul体系PCR扩大：按照以下体系配置
[0026][0027][0028]加完混匀后，按照以下PCR条件扩增：
[0029][0030]C、连接、转化
[0031]PCR产物和pET28a
‑
SUMO
‑
JT载体在连接酶的作用下连接2h；
[0032]转化至TOP10宿主细胞；
[0033]倒置平板，于37℃恒温培养箱中培养，12～16小时后可出现菌落；
[0034]D、重组子筛选鉴定
[0035]分装40ul不加抗生素的LB培养基至PCR管，每种克隆挑取8个单菌落至PCR管混匀，放置于37℃摇床中220r/2小时；每管取2ul作为模板进行菌液PCR，结果呈阳性的则可以送去测序鉴定；
[0036]E、测序鉴定。
[0037]实施例2蛋白表达纯化
[0038]1、小量表达与鉴定
[0039]A、将得到的正确的重组表达质粒转化表达感受态细胞Rosetta(DE3)；
[0040]B、于37℃培养箱中倒置培养过夜；
[0041]C、挑取阳性单菌落转入至含有抗生素的3ml LB培养基中，37℃200rpm过夜培养。取30ul过夜培养的菌液加入到3mlLB培养基中，37℃200rpm；
[0042]D、培养至OD值为0.6；剩余的菌液加甘油于
‑
80℃保存备用；
[0043]E、加入IPTG至终浓度1mmol/L进行诱导，并设置对照组，37℃200rpm诱导3h；
[0044]取200ul菌液，12000g离心30s，弃上清，菌体用40μl 1X SDS
‑
PAGE上样缓冲液重悬，沸水浴5min后，取10ul进行蛋白电泳检测。
[0045]结果如图1所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)选择甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A中抗原性强的蛋白片段的编码核酸序列，设计引物对BnTZF1A
‑
RRF和BnTZF1A
‑
TZFR进行克隆，构建重组原核表达载体；(2)将步骤(1)中的重组原核表达载体转化表达细胞进行蛋白表达，得蛋白表达培养物；(3)将步骤(2)蛋白表达培养物进行纯化，将纯化得到的目标产物进行动物免疫诱导抗体产生，最后对抗体纯化即得甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A的多克隆抗体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中编码核酸序列如SEQ ID NO:1所示。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中BnTZF1A
‑
RRF序列如SEQ ID NO:2所示，BnTZF1A
‑
TZFR序列如SEQ ID NO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄勇，潘娇，张蕾，陈敏，阮雨萱，刘博宇，阮颖，皮博艺，何小力，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：