一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法技术

本发明专利技术公开了一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，诱导步骤如下：a.首先选用280只老鼠被用作研究；b.待步骤a完成后，再将老鼠放置在特殊病原体的自由的设备及其水和食物自由；c.待步骤b完成后，再将老鼠被随机的分为普通对照组、MNU组、MNU+褪黑素组和MNU+空白组；d.待步骤c完成后，再对老鼠进行视动行为测试，反应阈值通过正确追踪反应的功能确定，最初刺激设置为0.200周/度的正弦模式及其固定的100％对比，接着对老鼠进行视网膜电图检查。本发明专利技术通过在诱导剂MNU内添加褪黑素，能够直接清除自由基，还能够提高内源性抗氧化酶的产生，而且褪黑素治疗有助于Cu

【技术实现步骤摘要】
一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法


[0001]本专利技术涉及白内障
，具体为一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法。

技术介绍

[0002]视网膜是光敏组织，它位于眼球的后极部。它源于复杂的微电路的层状结构，这些微电路协同工作来处理视觉信号。对视网膜损害将造成不可逆地视觉损伤。视网膜色素变性是一类遗传性视网膜病其特是退行性光感受器死亡。RP的病理过程受分子、细胞和组织水平因子的影响。鉴于巨大的异质极影响病因，RP病人总是有极大地易变发病点，进行性动态及其预后结果。这些易变性给精确治疗带来地极大地挑战。在临床阶断，没有药物能使RP病人光感受器死亡和视觉损害的中断。越来越多地证据表明氧化应激有助于RP光感受器的凋亡。过多的氧化自由基将干扰氧化还原的新陈代谢，改变线粒体膜的通透性及诱发光感受器的细胞色素c泄漏。过剩的氧化应激可被还原剂清除，光感受器可能存活时间更长其功能在合适的环境下发挥良好的作用。这个观点进一步被证明通过分子的抗氧化效能可以提升RP患者的视觉功能。
[0003]光感受器非常容易遭受氧化的损伤。它们的体内稳态需要大量的抗氧化剂直接对抗活性自由基。褪黑素是一种吲哚胺，主要通过松果体以昼夜节律性的方式合成的。视网膜是主要的生物节律信号的接受者，它被称作“光敏眼钟”。特别是，褪黑激素也是由光感受器合成的，以提高视觉灵敏度。褪黑素的受体集中在光感受器的突触末端部位，褪黑素有极大地可能介导光感受器的有益效应。一些证据表明了外源性褪黑素对视网膜提供细胞保护效应。褪黑素可以协同维生素E共同缓解视网膜内一氧化氮诱导的脂质过氧化。对比分析显示褪黑素保护抑制光诱导的氧化损伤大约是维生素E的100倍。褪黑素也可缓解氧化损伤和糖尿病视网膜病中的血管堵塞。另一个体外研究表明外源性褪黑素提升视杆光感受器和视网膜色素上皮层细胞的存活，这两个都涉及RP的发病机理。而且，外源性褪黑素也保护眼部疾病的物模型，如神经性青光眼，视网膜缺血
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再灌注性损伤，早产儿视网膜病。褪黑素可以通过清除氧自由基，刺激细胞内的抗氧化酶的激活，稳定线粒体传递电子链及其调控凋亡基因的表达。
[0004]N
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甲基N
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亚硝基脲(MNU)是通过系统注射诱导光感受器细胞快速死亡的烷基化毒性物质。MNU给药小鼠典型地被用作化学诱导的RP动物模型。MNU与DNA相互作用，MNU给药6小时后光感受器核内选择性地产生7
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甲基呱DNA结合物。光感受器内的凋亡级联在MNU给药12小时后被激活，最终使Bcl
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2水平下调。在这个时间点，核小体内的碎片可以在光感受器内看到。在MNU给药24小时后，第一个组织的改变可以被检测到。光感受器表现为核固缩以及内外节的缩短。在MNU给药48小时后，光感受器核的破坏最明显。最终在七天的时候，由于光感受器丧失，光感受器退化的活动迹象变得模糊不清。目的是探索褪黑素对退行性光感受的保护效应。褪黑素被递送到MNU给药小鼠的玻璃体内。目的是寻找褪黑素对MNU给药小鼠的光感受的存活，视觉功能和视觉信号的传输是否有额外的保护效应。特别的是，倾向于
通过位置分析褪黑素的定性的治疗效应。这些发现将丰富对褪黑素的了解，对RP的治疗提供一个新的方向。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，解决了
技术介绍
中所提出的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，诱导步骤如下：
[0007]a.首先选用280只老鼠被用作研究；
[0008]b.待步骤a完成后，再将老鼠放置在特殊病原体的自由的设备及其水和食物自由；
[0009]c.待步骤b完成后，再将老鼠被随机的分为普通对照组、MNU组、MNU+褪黑素组和MNU+空白组；
[0010]d.待步骤c完成后，再对老鼠进行视动行为测试，反应阈值通过正确追踪反应的功能确定，最初刺激设置为0.200周/度的正弦模式及其固定的100％对比，接着对老鼠进行视网膜电图检查；
[0011]e.待步骤d完成后，再将小鼠被麻醉后转移到超高分辩率仪器的记录平台上，接着将甲基纤维系润滑剂涂抹在小鼠的角膜上，然后将探头放置在角膜的附近，直到视网膜的图像出现在屏幕上，最后用相关盒子对视神经头(ONH)进行定位，分别在距离ONH边缘相同距离的两侧进行8次测量；
[0012]f.待步骤e完成后，将视网膜标本置于电极陈列的记录室内，视网膜神经元模拟细胞外反应被Med
‑
64系统记录，电场电位波形用带通滤波器(100
‑
300Hz)处理并求得脉冲值，用环刺激时间直方图(PSTHs)和栅格图将视网膜神经节细胞(RGEs)进行分类，根据PSTHs分析进行ON和OFF反应；
[0013]g.待步骤f完成后，再用花生凝集素偶联Alexa Fluor 488，s
‑
视椎视蛋白和m
‑
视椎视蛋白分别用抗体与视网膜切片染色，之后用PBS冲洗，视网膜标本被Cyt3联合抗兔免疫球蛋白G(IgG)和4,6
‑
二胺基
‑2‑
苯基吲哚(DAPI)共同孵育，再使用Axio Vision软件对ONL周围的四个420*420箱内的锥细胞进行定量；
[0014]h.待步骤g完成后，再对老鼠进行末端脱氧尿苷三磷酸镍端标记检测，在其过程中外核层(ONL)的凋亡指数(AI)是通过TUNEL阳性核数/光感受器细胞核总数*100计算得到；
[0015]i.待步骤h完成后，再将老鼠吓死后将它们的眼睛取出，使用商业试剂提取视网膜切片中的总RNA然后使MACS
TM
DNA合成盒合成互补DNA，达到定量逆转录聚合酶链反应；
[0016]j.待步骤i完成后，再将视网膜组织加入到含有0.5％Triton X100(pH 7.4)的PBS中，然后用研磨机在冰冷的水中匀浆，组织在4℃下以500g离心5分钟，然后测定悬浮液中蛋白质含量，以使酶活性和氧化应激标记物的含量正常化，再根据之前的描述测量超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)的浓度，在其过程中铜锌超氧化物歧化酶活性被超氧化物歧化酶检测试剂盒分析，一个单位的铜锌超氧化物歧化酶活性被定义为在硝基蓝四唑还原率中引起半抑制酶的量，接着使用带有超微量比色皿的分光光度计来测量吸光度值，在550纳米的分光光度计上测量每个样品在超微量试管中的吸光度值，该值表示为U/mg蛋白质；
[0017]k.待步骤j完成后，再使用方差分析(ANOVE)对数据进行处理，随后使用
Bonferroni的事后分析，所有的数值均以均数+
‑
标准差(SD)表示，P值<0.05被认为具有统计学意义。
[0018]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述步骤a中老鼠均为C57/BL，8...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，其特征在于：诱导步骤如下：a.首先选用280只老鼠被用作研究；b.待步骤a完成后，再将老鼠放置在特殊病原体的自由的设备及其水和食物自由；c.待步骤b完成后，再将老鼠被随机的分为普通对照组、MNU组、MNU+褪黑素组和MNU+空白组；d.待步骤c完成后，再对老鼠进行视动行为测试，反应阈值通过正确追踪反应的功能确定，最初刺激设置为0.200周/度的正弦模式及其固定的100％对比，接着对老鼠进行视网膜电图检查；e.待步骤d完成后，再将小鼠被麻醉后转移到超高分辩率仪器的记录平台上，接着将甲基纤维系润滑剂涂抹在小鼠的角膜上，然后将探头放置在角膜的附近，直到视网膜的图像出现在屏幕上，最后用相关盒子对视神经头(ONH)进行定位，分别在距离ONH边缘相同距离的两侧进行8次测量；f.待步骤e完成后，将视网膜标本置于电极陈列的记录室内，视网膜神经元模拟细胞外反应被Med
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64系统记录，电场电位波形用带通滤波器(100
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300Hz)处理并求得脉冲值，用环刺激时间直方图(PSTHs)和栅格图将视网膜神经节细胞(RGEs)进行分类，根据PSTHs分析进行ON和OFF反应；g.待步骤f完成后，再用花生凝集素偶联Alexa Fluor 488，s
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视椎视蛋白和m
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视椎视蛋白分别用抗体与视网膜切片染色，之后用PBS冲洗，视网膜标本被Cyt3联合抗兔免疫球蛋白G(IgG)和4,6
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二胺基
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苯基吲哚(DAPI)共同孵育，再使用Axio Vision软件对ONL周围的四个420*420箱内的锥细胞进行定量；h.待步骤g完成后，再对老鼠进行末端脱氧尿苷三磷酸镍端标记检测，在其过程中外核层(ONL)的凋亡指数(AI)是通过TUNEL阳性核数/光感受器细胞核总数*100计算得到；i.待步骤h完成后，再将老鼠吓死后将它们的眼睛取出，使用商业试剂提取视网膜切片中的总RNA然后使MACS
TM
DNA合成盒合成互补DNA，达到定量逆转录聚合酶链反应；j.待步骤i完成后，再将视网膜组织加入到含有0.5％Triton X100(pH 7.4)的PBS中，然后用研磨机在冰冷的水中匀浆，组织在4℃下以500g离心5分钟，然后测定悬浮液中蛋白质含量，以使酶活性和氧化应激标记物的含量正常化，再根据之前的描述测量超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)的浓度，在其过程中铜锌超氧化物歧化酶活性被超氧化物歧化酶检测试剂盒分析，一个单位的铜锌超氧化物歧化酶活性被定义为在硝基蓝四唑还原率中引起半抑制酶的量，接着使用带有超微量比色皿的分光光度计来测量吸光度值，在550纳米的分光光度计上测量每个样品在超微量试管中的吸光度值，该值表示为U/mg蛋白质；k.待步骤j完成后，再使用方差分析(ANOVE)对数据进行处理，随后使用Bonferroni的事后分析，所有的数值均以均数+
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标准差(SD)表示，P值<0.05被认为具有统计学意义。2.根据权利要求1所述的一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，其特征在于：所述步骤a中老鼠均为C57/BL，8
‑
9周大的雌雄鼠，体重范围在18
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23g。3.根据权利要求1所述的一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，其特征在于：所述步骤b中设备的温度为18
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23℃，40
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65％的湿度，12小时循环暗/灯照射。4.根据权利要求1所述的一种药物(调往诱导剂MNU)诱导自发性白内障的方法，其特征在于：所述步骤c中普通对照组，老鼠没有任何的药物注射，MNU组：老鼠接受静脉注射MNU
(60mg/kg)，MNU+褪黑素组：老鼠接受玻璃体递送褪黑素，MNU+空白组...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶冶，杜恩明，王刚，宋宗明，
申请(专利权)人：河南省人民医院，
类型：发明
国别省市：