光片荧光显微镜制造技术

提供了一种光片荧光显微镜，包括：光源设备，被配置为发射适于诱发从样品发射的荧光的激发光；检测器设备，被配置为检测来自所述样品的荧光；以及光学系统，被配置为用由所述激发光形成的光片照明所述样品并将所述荧光从被照明的所述样品引导到所述检测器设备，其中所述光学系统包括面向所述样品的物镜，所述物镜被配置为收集从所述样品发射的所述荧光，其中所述光源设备还被配置为发射适于对所述样品进行光操纵的操纵光，并且其中所述光学系统还被配置为沿着不同于所述光片的光传播方向的光传播方向将所述操纵光通过所述物镜的入射光瞳的空间受限子区域导引到所述样品上。射光瞳的空间受限子区域导引到所述样品上。射光瞳的空间受限子区域导引到所述样品上。

【技术实现步骤摘要】
光片荧光显微镜


[0001]本专利技术涉及一种光片荧光显微镜。另外，本专利技术涉及一种借助于光片荧光显微镜使样品成像的方法。

技术介绍

[0002]光片荧光显微镜术是一种技术，其中用特定的激发光分布照明样品的薄片，该特定的激发光分布例如通过使用柱面透镜而仅聚焦在一个方向上。另一种照明方法使用在一个方向上扫描的准直光束，以创建形成光片的光分布。由于实际上观察的样品的只一部分被照明的事实，因此光片荧光显微术减少在活体样品上引起的光损伤和应力。此外，与逐点扫描样品的共焦激光扫描显微术形成对比，光片荧光显微术是一种宽视场技术，它允许基于穿过样品的不同平面的光学截面来生成图像的三维堆栈。
[0003]在通常的方法中，光片荧光显微镜包括分离的物镜，用于用光片照明样品并用于观察被照明的物体平面。近来，已经开发出了仅使用一个物镜进行照明和检测的光片方法。例如，通过照明高NA物镜的光瞳的小斑点，可以生成倾斜的光片。因此，使用倾斜的检测器配置对倾斜的物体平面成像。这种技术被称为“斜面显微术”(OPM)。通过使用扫描镜同时移动光片和待成像的物体平面，已经开发出了称为“扫掠共焦对准的平面激发显微术”(SCAPE)的OPM的扩展。
[0004]除了仅对样品成像外，光操纵(即，借助于光施加来操纵样品)变得越来越重要。因此，可以在实际成像期间或之前通过例如加热、漂白、光活化、光失活等对样品进行光操纵。为此，可以将具有合适的强度和波长的激光束导引到样品。
[0005]在光片荧光显微术领域中，例如，在DE 10 2007 047 464A1中公开了能够光操纵样品的系统。这个系统包括两个物镜，用于照明样品和用于检测样品中诱发的荧光。在光学检测路径中，提供用于将操纵光导引到样品上的装置。但是，这种已知系统在适用性方面不够灵活。例如，该系统不适用于OPM或SCAPE配置。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供光片荧光显微镜和用于对样品成像的方法，其允许对样品进行灵活且高效的光操纵。
[0007]通过以下光片荧光显微镜来实现上面提到的目的。
[0008]该光片荧光显微镜包括光源设备、检测器设备和光学系统，光源设备被配置为发射适于诱发从样品发射的荧光的激发光。检测器设备被配置为检测来自样品的荧光。光学系统被配置为用由激发光形成的光片照明样品，并将荧光从被照明的样品引导到检测器设备。光学系统包括面向样品的物镜，物镜被配置为收集从样品发射的荧光。光源设备还被配置为发射适于对样品进行光操纵的操纵光。光学系统还被配置为沿着与光片的光传播方向不同的光传播方向将操纵光通过物镜的入射光瞳的空间受限子区域导引到样品上。
[0009]在以下描述中定义了有利的实施例。
[0010]一种光片荧光显微镜包括：光源设备，被配置为发射适于诱发从样品发射的荧光的激发光；检测器设备，被配置为检测来自样品的荧光；以及光学系统，被配置为用由激发光形成的光片照明样品并将荧光从被照明的样品引导到检测器设备。光学系统包括面向样品的物镜，其中该物镜被配置为收集从样品发射的荧光。光学系统还被配置为沿着不同于光片的光传播方向的光传播方向将操纵光通过物镜的入射光瞳的空间受限子区域导引到样品上。
[0011]在下文中，激发光或照明光应当被理解为被施加到样品以便诱发从其发出的并且适于被检测以使样品成像的光。换句话说，如本文所定义的激发光或照明光直接涉及成像过程。特别地，照明光或激发光可以是激发样品以发射荧光的光，用于生成表示被照明的样品的结构信息的光学图像。
[0012]另一方面，操纵光应当被理解为施加到样品以便借助于光以超出纯成像的方式操纵样品的光。例如，操纵光可以包括用于例如在光遗传学等领域中加热、切割、光活化、光失活、漂白、触发化学反应的光。
[0013]光片荧光显微镜操作，以便用操纵光部分地照明物镜的入射光瞳，以便在特定的实验环境下沿着期望的方向对样品进行光操纵。因此，应用部分光瞳照明允许通过改变操纵光被导引到其上的入射光瞳的子区域来灵活地调整操纵光沿着其传播到样品中的方向。当操纵光的传播方向被调整为与光片传播到样品中的方向不同时，可以根据由具体实验设置引起的需要或偏好自由选择被光片照明的物体平面内的感兴趣区域以进行光操纵。
[0014]光片荧光显微镜可用在广泛的应用中。特别地，通过入射光瞳的专用子区域对样品进行光操纵允许显微镜有利地以OPM或SCAPE配置使用，但不限于此。
[0015]因而，光学系统可以被配置为通过物镜用光片照明样品。因此，面向样品的物镜通常用于用激发光照明样品并用操纵光对其进行光操纵以及用于观察被照明的平面。
[0016]空间受限的子区域可以定位为相对于物镜的入射光瞳的中心偏移。通过改变距光瞳中心的偏移距离，可以根据具体实验的要求容易地调整操纵光的传播方向。
[0017]光学系统可以优选地被配置为将激发光通过入射光瞳的另一个空间上受限的子区域导引到样品上，其中这另一个子区域定位为相对于操纵光通过其被导引到样品上的子区域偏移。这个实施例可以有利地应用于OPM和SCAPE配置中。
[0018]优选地，从物镜朝着样品发出的操纵光的光传播方向相对于与由样品发射的荧光的光传播方向相反的方向成0
°
至
±
45
°
的角度范围内的角。具体而言，可以将上面提到的角度设置为零，即，在与检测轴直接相反的方向上将操纵光照射到样品上。这有助于准确地对样品进行光操纵。
[0019]在优选实施例中，光学系统包括扫描镜设备，该扫描镜设备包括至少一个倾斜镜，该倾斜镜是可倾斜的，用于反射激发光，以使光片整体上在与光片的光传播方向成横向的光片扫描方向上移动通过样品。
[0020]优选地，至少一个扫描镜是可倾斜的，用于反射激发光和操纵光两者。因此，激发光和操纵光可以被共同扫描通过样品，从而可以容易地以协调的方式执行成像和光操纵。
[0021]在具体实施例中，扫描镜设备可以包括扫描透镜和位于扫描透镜的后焦平面中的一个单个倾斜镜。通过如上面所提到的那样布置倾斜镜和扫描透镜，确保激发光的倾斜移动被转换成激发透镜在扫描透镜的物侧上的平行位移。因此，可以通过样品适当地扫描光
片。
[0022]在优选实施例中，扫描镜设备包括两个倾斜镜，其定位为沿着光学系统的光轴彼此偏移。这种配置允许可以省去扫描透镜。因此，使用两个倾斜镜而不是一个单个反射镜提供了附加的自由度，其可以被用于自由地调整(虚拟)轴以倾斜激发光。
[0023]另外，在扫描镜设备设有两个倾斜镜的情况下，可以容易地控制这些反射镜以在两个倾斜状态之间切换，两个倾斜状态之一被应用以便用激发光照明样品，而另一个倾斜状态被应用以进行光操纵。扫描镜设备可以在几毫秒内迅速地执行照明和光操纵之间的切换，这是非常有利的，例如，在生物样品中应观察到快速过程的情况下。
[0024]优选地，至少一个倾斜镜是可倾斜的，以将由物镜收集的荧光朝着检测器设备反射。这允许显微镜被用于去扫描配置，如例如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种光片荧光显微镜(100，100a，100b)，包括：光源设备(102，202，302)，被配置为发射适于诱发从样品(110)发射的荧光(F)的激发光(E)，检测器设备(104，304)，被配置为检测来自所述样品(110)的所述荧光(F)，以及光学系统(106、306)，被配置为用由所述激发光(E)形成的光片(LS)照明所述样品(110)，并将所述荧光(F)从被照明的所述样品(110)引导到所述检测器设备(104，304)，其中所述光学系统(106，306)包括面向所述样品(110)的物镜(108)，所述物镜(108)被配置为收集从所述样品(110)发射的所述荧光(F)，其中所述光源设备(102，202，302)还被配置为发射适于对所述样品(110)进行光操纵的操纵光(M)，并且其中所述光学系统(106，306)还被配置为沿着与所述光片(LS)的光传播方向不同的光传播方向将所述操纵光(M)通过所述物镜(108)的入射光瞳(EP)的空间受限子区域导引到所述样品(110)上。2.根据权利要求1所述的光片荧光显微镜(100，100a，100b)，其中所述光学系统(106，306)被配置为通过所述物镜(108)用所述光片(LS)照明所述样品(110)。3.根据权利要求1或2所述的光片荧光显微镜(100，100a，100b)，其中所述空间受限子区域定位为相对于所述物镜(108)的所述入射光瞳(EP)的中心偏移。4.根据权利要求2或3所述的光片荧光显微镜(100，100a，100b)，其中所述光学系统(106，306)被配置为通过所述入射光瞳(EP)的另一个空间受限子区域将所述激发光(E)导引到所述样品(110)上，所述另一个子区域定位为相对于所述操纵光(M)通过其被导引到所述样品(110)上的所述子区域偏移。5.根据前述权利要求中任一项所述的光片荧光显微镜(100，100a，100b)，其中从所述物镜(108)朝着所述样品(110)发出的所述操纵光(M)的所述光传播方向相对于与由所述样品发射的所述荧光的光传播方向相反的方向具有在0到
±
45
°
的角度范围内的角度。6.根据前述权利要求中任一项所述的光片荧光显微镜(100，100a，100b)，其中所述光学系统(106，306)包括扫描镜设备(116，316)，所述扫描镜设备包括至少一个倾斜镜(122，332，334)，所述至少一个倾斜镜(122，332，334)是可倾斜的，用于反射所述激发光(E)以使所述光片(LS)整体上在与所述光片(LS)的所述光传播方向成横向的光片扫描方向移动通过所述样品(110)。7.根据权利要求6所述的光片荧光显微镜(100，100a，100b)，其中所述至少一个扫描镜(122，332，334)是可倾斜的，用于反射所述激发光(E)和所述操纵光(M)两者。8.根据权利要求6或7所述的光片荧光显微镜(100，100a)，其中所述扫描镜设备(116)包括扫描透镜(118)和位于所述扫描透镜(118)的后焦平面中的一个单个倾斜镜(122)。9.根据权利要求6或7所述的光片荧光显微镜(100b)，其中所述扫描镜设备(316)包括两个倾斜镜(332，334)，所述两个倾斜镜(332，334)定位为沿着所述光学系统(306)的光轴(O)彼此偏移。10.根据权利要求6至9中任一项所述的光片荧光显微镜(100，100a，100b)，其中所述扫描镜设备(116，316)被配置为当所述激发光(E)被所述至少一个扫描镜(122，332，334)反射时使所述激发光(E)的主光线平行地移置。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的光片荧光显微镜(100，100a，100b)，其中所述至少一个倾斜镜(122，332，334)是可倾斜的，以将由所述物镜(108)收集的所述荧光(F)朝着所述检测器设备(104，304)反射。12.根据权利要求7至11中任一项所述的光片荧光显微镜(100)，包括光学移位单元(126)，所述光学移位单元(126)被配置为使所述操纵光(M)在所述至少一个可倾斜的反射镜(122)上的入射位置移位，用于独立于所述荧光(F)的所述光传播方向和/或独立于所述光片(LS)的所述光传播方向而改变导引到所述样品(110)上的所述操纵光(M)的所述光传播方向。13.根据权利要求12所述的光片荧光显微镜(100)，其中所述光学移位单元(126)包括反射或发射所述操纵光(M)的至少一个元件，所述元件可移动以移位所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗罗里安，
申请(专利权)人：莱卡微系统CMS有限责任公司，
类型：发明
国别省市：