DNA纯化方法、基因组DNA的提取方法、测序方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种DNA纯化方法、基因组DNA的提取方法、测序方法和试剂盒。该DNA纯化方法包括：(1)利用氨基磁珠对含有DNA的样本进行第一纯化处理，以便获得第一纯化产物；(2)利用羧基磁珠对所述第一产物进行第二纯化处理，以便获得第二纯化产物。应用该方法可以用作基因组DNA的提取，可以获得高纯度的DNA，应用于三代测序技术中。测序技术中。

【技术实现步骤摘要】
DNA纯化方法、基因组DNA的提取方法、测序方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种DNA纯化方法、基因组DNA的提取方法、测序方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]二代测序已在基因组测序中广泛应用，但是二代测序仅能产生短读长。高等真核生物，特别是植物的基因组含有大量重复序列，长度可达数万个碱基，二代测序显然无法应对这样复杂的序列测序。随着PacBio公司的SMRT单分子测序技术和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技术的兴起，基因组测序可以直接进行长片段的测序，以获取更好的组装效果。然而，用于长片段单分子测序的酶对与DNA结合的污染物高度敏感，所以对基因组DNA的制备要求更高，要求提取得到高纯度的大片段基因组。
[0003]使用有机试剂抽提获取基因组DNA存在几个问题：有机试剂存在毒性、提取操作繁琐、DNA纯度不高等问题。
[0004]利用磁珠法提取DNA可部分解决以上问题，且可实现自动化大批量操作。但是利用磁珠法提取的DNA纯度仍然不满足三代测序的需求，仍需进一步改进。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种DNA纯化方法、基因组DNA的提取方法、测序方法和试剂盒。
[0006]目前磁珠法主要采用羧基磁珠进行基因组DNA提取，但是对于多糖多酚样本，羧基磁珠在吸附DNA时会吸附大量杂质，使得提取得到的DNA存在粘稠、有色、OD值不合格的问题。如何提取获得高纯度的DNA，满足三代测序的需求，直接影响到测序质量以及测定结果的准确分析。专利技术人在研究过程中发现：在DNA纯化的过程中，或者在基因组DNA的提取过程中，首先应用氨基磁珠进行处理，可以有效去除DNA中的多糖多酚物质；然后利用羧基磁珠进行处理，可以进一步提高DNA的纯度；由此可以提高所DNA的纯度，获得高纯度的DNA可以满足三代测序的需求。
[0007]具体而言，本专利技术提供了如下技术方案：
[0008]在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种DNA纯化方法，包括：(1)利用氨基磁珠对含有DNA的样本进行第一纯化处理，以便获得第一纯化产物；(2)利用羧基磁珠对所述第一纯化产物进行第二纯化处理，以便获得第二纯化产物。本专利技术所提供的DNA纯化方法，首先利用氨基磁珠进行第一纯化处理，氨基磁珠上的官能团-NH2带有正电荷，能够吸附带有负电的DNA，去除含有DNA的样本中的大量杂质，在该过程中仅会吸附少量杂质，所获得的第一纯化产物由此可以去除掉大量杂质；然后利用羧基磁珠进行第二纯化处理，可以进一步去除杂质，获得高纯度的DNA。例如所获得的第二纯化产物中DNA的OD260/280在1.85以上，OD260/230在1.95以上，可以满足三代测序的需求。
[0009]根据本专利技术的实施例，以上所述DNA纯化方法可以进一步包括如下技术特征：
[0010]在本专利技术的一些实施例中，步骤(1)进一步包括：(1-1)在低浓度盐溶液条件下，利用氨基磁珠对所述含有DNA的样本进行第一吸附处理，以便获得第一吸附产物；(1-2)在高浓度盐溶液条件下，对所述第一吸附产物进行第一洗脱处理，以便获得所述第一纯化产物；所述高浓度盐溶液的盐浓度高于所述低浓度盐浓度的盐浓度。在低浓度盐溶液条件下，氨基磁珠可以吸附DNA，仅吸附少量杂质，使得DNA被吸附到氨基磁珠上，以此去除大量杂质；然后利用高浓度的盐溶液对于吸附有DNA的氨基磁珠进行洗脱处理，可以将DNA从氨基磁珠上洗脱下来，方面后续进一步纯化处理。本文中“低浓度盐溶液”和“高浓度盐溶液”是相对而言的，仅表示在进行第一洗脱处理时的盐溶液的浓度要高于在进行第一吸附处理时的盐溶液浓度。
[0011]在本专利技术的一些实施例中，所述高浓度盐溶液的使用浓度至少为1M，优选为2M。由此可以将DNA从氨基磁珠上快速洗脱下来。当然，盐溶液的浓度过高时，洗脱的DNA基本不会发生改变，例如使用3M的盐溶液进行洗脱与使用2M的盐溶液进行洗脱，不会影响到DNA的纯度和得率，所以高浓度盐溶液的使用浓度可以在1M～3M之间，所使用的高浓度盐溶液还不会影响到后续羧基磁珠的纯化过程。
[0012]在本专利技术的一些实施例中，所述低浓度盐溶液的使用浓度不超过0.2M。由此可以使得DNA被吸附到氨基磁珠上，且很少会吸附杂质。
[0013]在本专利技术的一些实施例中，所述高浓度盐溶液为氯化钠溶液。
[0014]在本专利技术的一些实施例中，步骤(2)进一步包括：(2-1)利用羧基磁珠对所述第一纯化产物进行第二吸附处理，以便获得第二吸附产物；(2-2)利用醇溶液对所述第二吸附产物进行第二洗脱处理，以便获得所述第二纯化产物。通过羧基磁珠进行处理，可以进一步纯化DNA，去除杂质，获得高纯度的DNA。
[0015]在本专利技术的一些实施例中，所述醇溶液的体积浓度为70％～90％，所述醇溶液优选为体积浓度70％～80％的乙醇溶液。由此可以有效去除溶液中的盐。
[0016]在本专利技术的第二方面，本专利技术提供了一种基因组DNA的提取方法，包括：(a)将样本和裂解液、蛋白酶和核糖核酸酶混合，反应，分离获得含有DNA的上清液；(b)利用氨基磁珠对所述含有DNA的上清液进行第一纯化处理，以便获得第一纯化产物；(c)利用羧基磁珠对所述第一纯化产物进行第二纯化处理，以便获得第二纯化产物。
[0017]本专利技术提供了一种基因组DNA的提取方法，该方法通过利用裂解液、蛋白酶和核糖核酸酶(RNase酶)对样本进行处理，分离获得含有DNA的上清液；然后利用氨基磁珠进行第一纯化处理，通过吸附DNA，去除大量杂质，获得第一纯化产物；进一步地，利用羧基磁珠对第一纯化产物进行第二纯化处理，获得第二纯化产物。所获得第二纯化产物中的DNA纯度很高，例如DNA的OD260/280在1.85以上，OD260/230在1.95以上。应用该方法可以得到高纯度的大片段基因组DNA，高纯度的DNA可以满足三代测序的需求，有助于提升测序读长和测序质量。
[0018]根据本专利技术的实施例，以上所述基因组DNA的提取方法可以进一步包括如下技术特征：
[0019]在本专利技术的一些实施例中，所述裂解液包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，焦亚硫酸钠，氯化钠，三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，EDTA和吐温20。由此可以通过裂解细胞，分离获得含有DNA的上清液；而且不会影响到后续氨基磁珠的纯化处理过程。
[0020]在本专利技术的一些实施例中，所述裂解液包括质量浓度为1％～3％的聚乙烯吡咯烷酮，质量浓度为1％～3％的焦亚硫酸钠，0.1～0.5M的氯化钠，80～300mM的三羟甲基氨基甲烷，30～200mM的EDTA和体积浓度为1％～5％的吐温20。由此可以有效裂解组织和细胞。
[0021]在本专利技术的一些实施例中，所述蛋白酶为蛋白酶K，所述核糖核酸酶为核糖核酸酶A(RNase A)。核糖核酸酶A作为内切核糖核酸酶，可以特异地攻击RNA上嘧啶残基的3<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA纯化方法，其特征在于，包括：(1)利用氨基磁珠对含有DNA的样本进行第一纯化处理，以便获得第一纯化产物；(2)利用羧基磁珠对所述第一纯化产物进行第二纯化处理，以便获得第二纯化产物。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)进一步包括：(1-1)在低浓度盐溶液条件下，利用氨基磁珠对所述含有DNA的样本进行第一吸附处理，以便获得第一吸附产物；(1-2)在高浓度盐溶液条件下，对所述第一吸附产物进行第一洗脱处理，以便获得所述第一纯化产物；所述高浓度盐溶液的盐浓度高于所述低浓度盐溶液的盐浓度。3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述高浓度盐溶液的使用浓度至少为1M，优选为2M；任选地，所述低浓度盐溶液的使用浓度不超过0.2M；任选地，所述高浓度盐溶液为氯化钠溶液。4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括：(2-1)利用羧基磁珠对所述第一纯化产物进行第二吸附处理，以便获得第二吸附产物；(2-2)利用醇溶液对所述第二吸附产物进行第二洗脱处理，以便获得所述第二纯化产物；任选地，所述醇溶液的体积浓度为70％～90％，所述醇溶液优选为体积浓度70％～80％的乙醇溶液。5.一种基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括：(a)将样本和裂解液、蛋白酶和核糖核酸酶混合，反应，分离获得含有DNA的上清液；(b)利用氨基磁珠对所述含有DNA的上清液进行第一纯化处理，以便获得第一纯化产物；(c)利用羧基磁珠对所述第一纯化产物进行第二纯化处理，以便获得第二纯化产物。6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，步骤(a)中所述裂解液包括聚乙烯吡咯烷酮，焦亚硫酸钠，氯化钠，三羟甲基氨基甲烷，EDTA和吐温20；任选地，所述裂解液包括质量浓度为1％～3％的聚乙烯吡咯烷酮，质量浓度为1％～3％的焦亚硫酸钠，0.1～0.5M的氯化钠，80～300mM的三羟甲基氨基甲烷，30～200mM的EDTA和体积浓度为1％～5％的吐温20；任选地，所述蛋白酶为蛋白酶K，所述核糖核酸酶为核糖核酸酶A；任选地，在50～65摄氏度下进行所述反应，所述反应时间为1～3小时。7.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述样本为植物样本；任...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐冲，陈智超，阮凤英，郭梅，杨林峰，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技服务有限公司，
类型：发明
国别省市：