一种灭活非洲猪瘟病毒的方法及其活性检测技术

本发明专利技术公开了一种灭活非洲猪瘟病毒的方法及活性检测，以受非洲猪瘟病毒ASFV污染的饲料为对象，采用高能电子束进行辐照，对辐照后的饲料采用Long-Range PCR/qPCR或Long-Range PCR/LAMP的方法，检测其所含非洲猪瘟病毒ASFV的TCID

【技术实现步骤摘要】
一种灭活非洲猪瘟病毒的方法及其活性检测


[0001]本专利技术是一种灭活非洲猪瘟病毒的方法及其活性检测，具体涉及采用高能电子束灭活饲料中的非洲猪瘟病毒（ASFV）的技术以及用于辐照后病毒的活性检测方法，属于食品安全领域。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟是由ASFV(African Swine Fever Virus，ASFV)感染引起的。ASFV是ASFV科的唯一成员，尚未发现有亲缘的病毒。ASFV可以感染家猪和野猪，并引起急性出血热（非洲猪瘟），致死率接近100%。
[0003]非洲猪瘟最早于1900年在非洲东部暴发并相继传播至非洲西部及撒哈拉沙漠以南的许多国家。1957在葡萄牙里斯本报道了欧洲的首例非洲猪瘟疫情。到1990年非洲猪瘟已经扩散到了中、西欧洲以及加勒比海地区和南美洲。2007年格鲁吉亚和俄罗斯报道了非洲猪瘟疫情，此后东欧国家亦相继暴发非洲猪瘟。2018年8月我国辽宁沈阳首次首例非洲猪瘟疫情，并且传播迅速，截至 2018年底，已有23个省超过100多起家猪感染非洲猪瘟的报道。
[0004]ASFV的基因组和病毒颗粒十分复杂，侵染方式、成熟方式多样等原因，非洲猪瘟疫苗开发的进程缓慢，但至今仍未研制出可以商用的ASFV疫苗。所以ASFV的防控重点还是监测并切断各种可能的传播、感染途径。ASFV传播方式多样化，而且可以在各种猪肉制品和环境中存活相当长的时间，给ASFV的防控带来了相当大的挑战。据报道，饲料也是传播ASFV的途径之一，并且单次饲喂被污染的饲料引起感染的最低剂量为10
4 TCID
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。随着饲料中ASFV含量和受污染饲料饲喂次数的增加，感染机率也会逐步增加。如何灭活被污染饲料中的ASFV并且检测其活性是降低饲料途径传播ASFV的关键。
[0005]辐照很早便被应用于食品的杀菌。广泛的营养评估、毒性研究和喂养试验表明辐照食品不存在任何风险，且辐照产生的营养变化甚至比巴氏杀菌产生的营养变化幅度都要小。近年来，电子束辐照陈为了食品辐照杀菌消毒的热点。已经有研究表明使用不同电子束辐照剂量对新城疫病毒、1型牛疱疹病毒和鸡传染性法氏囊病毒活性物质进行照射，可以完全灭活这3种病毒。有关辐照灭活病毒，如现有专利文献CN103167880A（灭活的水痘带状疱疹病毒疫苗、其生产方法及用途，2013.06.19）、CN105431171A（用于使用电子束射线来病毒灭活的方法，2016.03.23）等。
[0006]例如CN105431171A采用50至300 kGy的电子束辐照来灭活液体样品中病毒的免疫原成分或是疫苗，可灭活的病毒包括多种有/无包膜、单链/双链RNA和单链/双链DNA病毒，并通过滴定法检测了电子束辐照灭活后病毒的TCID
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值来反映病毒活性。CN105431171A还发现电子束灭活病毒后几乎完好地保存了病毒结构和抗原性，某些病毒如PRRSV（猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒）可在灭活后用于制备疫苗。
[0007]ASFV是单链DNA病毒，基因组长达180~196 kb。研究表明，ASFV基因组两端也存在重复序列和变异区，中间为中心保守区。除此外，ASFV自带DNA修复系统，但保真性十分低，
所以其基因组变异较大，给PCR检测ASFV带来了一定难度。但qPCR和LAMP仍是从环境样品中快速检测ASFV的主要方法。目前在ASFV的快速检测方面，已有专利文献CN110106290A（一种基于CRISPR/Cas系统用于检测ASFV的现场快速检测方法及试剂盒, 2019.08.09）， CN110453010A（一种用于检测非洲猪瘟病毒ASFV的LAMP引物组、试剂和试剂盒,2019.11.15）。
[0008]多种辐照都可以引起DNA不同形式的损伤，如单链/双链断裂、形成嘧啶二聚体。PCR过程中聚合反应的进行需要相对完整的DNA链，任何断裂、嘧啶二聚体都会阻断聚合反应。所以PCR已被广泛应用于检测断裂、形成嘧啶二聚体等细胞DNA损伤。病毒的繁殖亦要求相对完整的基因组DNA，所以已有文献表明可以尝试通过PCR法检测辐照后病毒基因组的完整性而评价其活性。比如R.A. Rodri
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guez和S. Bounty结合Long-Range PCR和qPCR对紫外照射后腺病毒2型的活性进行了评价（Long-range quantitative PCR for determining inactivationof adenovirus 2 by ultraviolet light）；Brian M. Pecson建立了评价经紫外辐照的噬菌体MS2的活性的方法（Framework for Using Quantitative PCR as a Nonculture Based MethodTo Estimate Virus Infectivity）。
[0009]对于饲料生产企业而言，除了需要ASFV检测技术以检测饲料生产过程中是否受到污染外，如何灭活被污染的饲料并检测灭活处理后病毒是否仍具有活性，是降低生产损失的关键之一。这对于规模化的生猪养殖场而言同样重要，所以迫切需要一种可以灭活饲料或器材中ASFV的技术和快速检测其活性的方法。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的在于提供一种灭活非洲猪瘟病毒的方法，采用高能电子束辐照技术对受污染饲料中非洲猪瘟病毒ASFV进行灭活，实验表明，该技术可以使饲料中的ASFV含量降到单次饲喂的传染剂量之下。
[0011]本专利技术的另一目的在于提供一种非洲猪瘟病毒的活性检测方法，可实现辐照后饲料中ASFV活性的快速检测，实验表明，该检测方法的准确性可以达到90%，可以不需要进行依赖于细胞培养的病毒滴定，快速检测电子束辐照后饲料中残存的病毒的活性。
[0012]本专利技术通过下述技术方案实现：一种灭活非洲猪瘟病毒的方法，以受非洲猪瘟病毒ASFV污染的饲料为对象，采用高能电子束进行辐照。
[0013]根据辐照前，饲料中非洲猪瘟病毒ASFV浓度及其水分活度，选择高能电子束辐照的剂量范围。
[0014]采用LAMP技术可视化的检测辐照前饲料中非洲猪瘟病毒ASFV的浓度。
[0015]采用水分活度仪检测辐照前饲料中非洲猪瘟病毒ASFV的水分活度。
[0016]所述高能电子束的辐照剂量控制在10～25kGy。
[0017]所述饲料经高能电子束辐照后，非洲猪瘟病毒ASFV的TCID
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值不高于104。
[0018]本专利技术还涉及一种非洲猪瘟病毒的活性检测方法，以上述辐照后的饲料为对象，采用long range-PCR/qPCR或long rang-PCR/LAMP的方法，检测其所含非洲猪瘟病毒ASFV的TCID
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值。
[0019]包括以下步骤：（1）提取辐照后饲料中非洲猪瘟病毒ASFV基因组DNA；
（2）采用Long-Range PCR对基因组DNA进行扩增，获得long range...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种灭活非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：以受非洲猪瘟病毒ASFV污染的饲料为对象，采用高能电子束进行辐照。2.根据权利要求1所述的一种灭活非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：根据辐照前，饲料中非洲猪瘟病毒ASFV浓度及其水分活度，选择高能电子束辐照的剂量范围。3.根据权利要求2所述的一种灭活非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：采用LAMP技术可视化的检测辐照前饲料中非洲猪瘟病毒ASFV的浓度。4.根据权利要求2所述的一种灭活非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：采用水分活度仪检测辐照前饲料中非洲猪瘟病毒ASFV的水分活度。5.根据权利要求1所述的一种灭活非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：所述高能电子束的辐照剂量控制在10～25kGy。6.根据权利要求1所述的一种灭活非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：所述饲料经高能电子束辐照后，非洲猪瘟病毒ASFV的TCID
50
值不高于104。7.一种非洲猪瘟病毒的活性检测方法，其特征在于：以权利要求1所述辐照后的饲料为对象，采用Long-Range PCR/qPCR或Long-Rang PCR/LAMP的方法，检测其所含非洲猪瘟病毒ASFV的TCID
50
值。8.根据权利要求7所述的一种非洲猪瘟病毒的活性检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）提取辐照后饲料中非洲猪瘟病毒ASFV基因组DNA；（2）采用long range-PCR对基因组DNA进行扩增，获得long range
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PCR扩增产物，再依次进行步骤（3）、（4）或者依次进行步骤（5）、（6）；（3）对Long-Range PCR扩增产物进行qPCR或LAMP扩增；（4）根据qPCR或LAMP扩增结果，计算得到非洲猪瘟病毒ASFV的TCID
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值；（5）在Long-Range PCR扩增产物中加入染料后，再进行LAMP扩增，使LAMP扩增的结果可视化；（6）将LAMP扩增产物进行颜色比对，得到非洲猪瘟病毒ASFV的TCID
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值。9.根据权利要求8所述的一种非洲猪瘟病毒的活性检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中，按以下公式计算非洲猪瘟病毒ASFV的TCID
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值，TCID
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=e
b-ax
其中x为对Long-Range PCR产物进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙群，刘卓翀，余洋，龚国梅，
申请(专利权)人：四川生美思达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：