本发明专利技术涉及医学生物检测领域，具体为多肽组合标志物在制备糖尿病诊断试剂或试剂盒中的新用途。本发明专利技术提供了一种利用液相色谱-质谱多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)定量检测血清中内源多肽的方法及试剂盒，通过本发明专利技术中的试剂及方法，可以定量测定人血清中内源5个多肽标志物的含量，进而基于二元逻辑回归方程计算所述组合标志物变量以及确定的截点值，用于糖尿病的预警和/或诊断。本发明专利技术的试剂盒和检测方法稳定性好，特异性高，具有临床推广的潜力。有临床推广的潜力。有临床推广的潜力。
【技术实现步骤摘要】
一种用于糖尿病早期诊断的多肽组合标志物及检测试剂盒和方法
[0001]本专利技术涉及医学生物检测技术及代谢性疾病的诊断、预防和治疗领域，具体地说，是基于定量测定人血浆内源多肽的方法及多肽组合标志物在制备糖尿病早期预警和/或诊断的试剂盒和方法。
技术介绍
[0002]据2017年国际糖尿病联盟数据显示，全球糖尿病患者已有4.15亿，其中2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)占95％以上。预计到2030年，全球糖尿病患病人数将增至5.52亿。糖尿病是继心血管疾病和肿瘤后危害人类健康的第3大疾病。目前，虽然2型糖尿病的诊断标准已明确，具有口服葡萄糖耐量试验(OGTT)等金标准，但因其糖尿病初期无明显症状且潜伏期长，至症状出现或临床确诊后再干预治疗，病情往往已不可逆转，错失去了最佳干预时期，寻找用于早期预警及诊断的生物标志物对于研究糖尿病的病理、分类、早期诊断、延缓及预防糖尿病的发生具有重要意义。
[0003]采用多组学技术发现新的诊断标志物是当前研究的热点。多肽在糖尿病的发病过程及干预治疗中具有重要地位，如诸多的多肽药物如胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)类似物、度拉鲁肽(dulaglutide)、脑钠肽(brain natriuretic peptide，BNP)等肽类制剂。多肽可以体现不同生理病理条件下蛋白的合成、加工和降解过程，同时，对基因的表达、物质代谢等过程又有调节作用，因此，采用多肽组学技术发现新型多肽生物标志物用于糖尿病的早期预警/诊断具有巨大潜力。
[0004]标志物验证：目前已发现的2型糖尿病潜在生物标志物包括基因变异、RNA转录子、多肽、蛋白质、脂质和小分子代谢产物(支链氨基酸/芳香氨基酸)等，但多为来自并发症样本，如糖尿病肾病，糖尿病伴高血压及高血糖样本,妊娠糖尿病等(中国专利CN106645757A；医学综述,2019,(20),4080-4086；Mol Cell Proteomics，2010，9(10)，2099-2108；中华实用诊断与治疗杂志,2018,32(01),1-4)，一般出现并发症，糖尿病已处于确诊且不可逆转的后期阶段，缺少针对糖尿病本身及用于早期诊断的生物标志物；此外，采用多组学技术筛选出差异标志物后缺少进一步的临床样本验证工作，因此导致临床应用价值有限；或采用ELISA或Western blot验证，实验成本高且通量不足(中国专利CN108957011；色谱，2019，37(8)：853-862；中国全科医学,2014,(21),2524-2527)。
[0005]基于以上研究中存在的问题，本专利技术采用非靶向多肽组学和靶向定量多肽组学结合的方法，该方法具有通量高、数据重复性好、灵敏度高的特点。采用从发现到验证的策略筛选潜在的诊断标志物，从糖尿病前期临床样本(无并发症)中成功筛选并验证人血清中内源多肽的组合标志物，可用于糖尿病的早期预警及/或诊断，该组合标志物的诊断灵敏度和特异性均良好，并制备了一种可用于定量测定目标多肽含量及用于糖尿病早期预警和/或诊断的试剂盒，该试剂盒目前还未见报道。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的是针对糖尿病早期预警诊断标志物匮乏及灵敏度低、特异性低等问题，采用非靶向多肽组学发现差异多肽及靶向多肽组学验证的策略，提供一种组合多肽标志物在糖尿病早期预警/诊断中的应用及试剂盒，同时提供了可用于上述组合多肽标志物定量分析检测的方法。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0008](1)采用非靶向多肽组学的方法，对正常人、糖尿病初期患者、糖尿病患者(无高血压、高血脂等并发症)血清内源多肽进行非靶向分析，用无标定量的方法对差异多肽进行筛选，筛选条件包括P值、可信的置信区间等，保留满足条件的差异多肽。
[0009](2)对(1)中差异多肽，通过合成标肽及二甲基标记，采用靶向多肽组学的方法，在另批次健康人/糖尿病患者(无高血压、高血脂等并发症)临床样本中，对上述差异多肽进行验证。并考察多肽的稳定性，初步评估用于制备开发糖尿病早期预警/诊断试剂盒的潜力。
[0010](3)采用SPSS统计软件，通过二元逻辑回归分析，回归为组合标志物变量，采用ROC(receiver operating characteristic)曲线来评价组合标志物的灵敏性和特异性。
[0011](4)组合标志物的使用：在糖尿病患者中，多肽GVLSSRQLGLPGPPDVPDHAAYHPF(245)，GVLSSRQLGLPGPPDVPDHAA(244)，GLPGPPDVPDHAAYHPF(251)，GVNDNEEGFF(248)，GSEMVVAGKLQ(261)的含量发生明显变化。5条多肽回归为组合标志物变量X,二元逻辑回归方程为：
[0012]X＝4.162+4.364
×
C(245)+8.905
×
C(244)-2.725
×
C(251)-3.326
×
C(248)-14.677
×
C(261)
[0013]Prob(糖尿病)＝1/[1+e-X
][0014]其中C表示血浆多肽的浓度；e为欧拉数，自然对数函数的底数；Prob为组合标志物变量值，当P值大于等于0.55时，诊断为糖尿病患者，否则为无糖尿病人群。
[0015](5)诊断系统所包括的装置：色谱柱，检测仪器为液相色谱-质谱联用仪。
[0016](6)确定试剂盒组成，共包括A,B,C,D,E,F,G七种试剂或溶液，具体为：
[0017]二甲基标记试剂：A,PBS缓冲液(PH＝8.0～8.4)；B,体积浓度4％甲醛(轻标处理试剂)和/或体积浓度4％氘代甲醛(中标处理试剂)；C,0.6M氰基硼氢化钠(NaBH3CN)；D,质量浓度1％氨水；E,体积浓度5％甲酸溶液；
[0018]标准品溶液F：多肽(245，244，251，248，261)经二甲基轻标试剂处理得到的轻标溶液，经干燥、除盐、再次干燥后，溶于体积浓度0.1％-1％的甲酸，多肽的终浓度分别为10-40μg/mL；
[0019]含稳定同位素的内标溶液G：多肽(245，244，251，248，261)经二甲基标记中标试剂处理得到的中标溶液，经干燥、除盐、再次干燥后，溶于体积浓度0.1％-1％的甲酸，多肽的终浓度分别为0.3-10μg/mL。
[0020]具体步骤为：
[0021]1)超滤：取10-50μL血浆样品,10K Da超滤管离心提取内源多肽；干燥即得内源多肽样品；
[0022]2)轻标标记：将内源多肽样品采用上述二甲基标记轻标试剂A、B、C、D、E依次处理，得内源多肽二甲基标记样品(轻标)，干燥；
[0023]3)除盐：采用C18填料的TIP头或固相萃取小柱除盐，干燥；-80℃冰箱冷藏备用；
[0024]4)供试品溶液制备：将内源多肽轻标标记样品用10-50μL本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.多肽GVLSSRQLGLPGPPDVPDHAAYHPF(245)，GVLSSRQLGLPGPPDVPDHAA(244)，GLPGPPDVPDHAAYHPF(251)，GVNDNEEGFF(248)，GSEMVVAGKLQ(261)组合标志物在制备糖尿病预警和/或诊断试剂或试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述的多肽组合标志物在制备糖尿病早期预警/诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的诊断试剂或试剂盒检测血清中多肽245，244，251，248，261的含量。3.根据权利要求1所述的组合标志物在制备用于诊断受试者中的糖尿病患者的试剂盒中的应用，其特征在于，所述诊断试剂或试剂盒为采用液相色谱-质谱检测多肽(245，244，251，248，261)的含量的试剂的组合。4.一种早期预警/诊断糖尿病的检测试剂盒，其特征在于，所述诊断或试剂盒包括：(1)二甲基标记试剂：A,PBS缓冲液(PH＝8.0～8.4)；B,体积浓度4％甲醛(轻标处理试剂)和/或体积浓度4％氘代甲醛(中标处理试剂)；C,0.6M氰基硼氢化钠(NaBH3CN)；D,质量浓度1％氨水；E,体积浓度5％甲酸溶液；(2)标准品溶液F：多肽(245，244，251，248，261)经二甲基轻标试剂处理得到的轻标溶液，经干燥、除盐、再次干燥后，溶于体积浓度0.1％-1％的甲酸，多肽的终浓度分别为10-40μg/mL；(3)含稳定同位素的内标溶液G：多肽(245，244，251，248，261)经二甲基标记中标试剂处理得到的中标溶液，经干燥、除盐、再次干燥后，溶于体积浓度0.1％-1％的甲酸，多肽的终浓度分别为0.3-10μg/mL。5.一种采用权利要求4检测试剂盒对血清中多肽(24...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴仁安，王莉，周孝禹，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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