一种核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种细菌核酸提取用裂解结合液，由盐酸胍，EDTA，tritonX

【技术实现步骤摘要】
一种核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种核酸提取用裂解结合液，还涉及到应用该裂解结合液制备的核酸提取的试剂盒。

技术介绍

[0002]核酸提取在核酸分子检测领域是极其关键的一步。自1869年Miescher首次成功发现并分离出DNA，以及1957年Meselson M等首次采用密度梯度离心法分离DNA以来，报道了多种核酸提取方法，许多研究者在核酸的提取方法上进行了不懈的探索，对核酸的各种材料和试剂进行了改进，十二烷基磺酸钠、酚、脲和胍盐等各种试剂纷纷被应用到核酸提取实验中，各种用于核酸提取的商品化试剂盒也应运而生。其中，传统的提取方法主要有：酚抽提法、碱裂解法、CTAB抽提法和EtBr
‑
CsCl梯度离心法。这些传统提取方法可从不同组织样本中分离出DNA和RNA，但这些技术中包含沉淀和离心等操作步骤，其所需的生物样本量较大，且提取的步骤较为繁杂、费时费力，得率也不高，难以实现自动化操作，另外，大部分的传统方法中还需要用到有毒化学试剂，对操作人员的健康具有潜在危害，因此，伴随着分子生物学以及高分子材料学的发展，从液相系统中分离核酸的传统技术逐渐被以固相载体为基础的新方法所取代，目前常见固相材料有硅胶、玻璃颗粒、硅藻土、阴离子交换载体等。但这些固相法通常需采取数次快速离心、真空抽滤等步骤来实现分离，而且对于样本需求量大，耗费样品较多，不便于高通量、自动化操作，严重限制了在临床基因诊断领域的应用。
[0003]随着分子生物学技术的发展，为满足高通量处理样本和获得高质量核酸的实验要求，核酸提取分离技术也更趋向于简便快捷、高质量、高纯度和高通量发展，核酸质量的好坏直接决定了后续实验的成败。近年来分子诊断技术快速发展，随着基因测序等技术的成熟，成本进一步降低，在临床上的应用也越来越普遍。分子诊断检测的样本类型多达数十种，而处理后产物适用的检测项目也涵盖了荧光定量PCR、基因测序、基因芯片、生物质谱等各类分子生物学技术平台。然而，无论是哪一类检测项目，准确的检验结果无疑依赖于高质量的标本及标本前处理过程。因此临床分子诊断自动化趋势将逐步在国内临床实验室成为主导，而自动化首先将在目前手工操作较普及且对结果影响最大的核酸提取上实现。
[0004]采用磁珠提取法，核酸提取率和提取纯度主要受提取液的影响，如裂解液、结合液、洗涤液和洗脱液等，若提取样品的量和纯度不太高，不但不能有效的检出，甚至影响检测结果，甚至不能完全满足后续的实验要求。在为申请号201110124322.3一种增强的磁珠法核酸提取方法中也对传统的磁珠法核酸提取进行了改进，因当前的磁珠法核酸提取方法有两方面不足：首先是RNA的提取效率较低，其次是核酸提取步骤繁多，裂解与结合分为两步，磁珠在裂解完成之后才能加入溶液中结合核酸，不利于全自动化应用。该专利技术将样本的核酸裂解与核酸磁珠结合一步完成，游离的RNA在裂解液中高浓度盐和异丙醇作用下吸附到磁珠表面，最后通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，吸弃离心管内溶液，从而达到裂解和结合的目的。该专利技术在于核酸提取仅需4个步骤，分别是裂解与结合、清洗1、清洗2、洗脱，而前3个步骤都是通过加入异丙醇增强了溶液中磁珠吸附核酸的作用，从而增强
了磁珠法核酸提取的效率，其裂解结合时，生物样品、异丙醇与裂解液的体积比为1:1:2。并且在应用于RNA提取时提供了一种高效提取RNA的方法。使得裂解与结合一步完成，在应用于自动化核酸提取时每一步骤的反应试剂可以预先灌装入该步骤对应的反应舱内，使该专利技术更适用于全自动化应用。但是异丙醇对眼、呼吸道的黏膜有刺激作用，能损伤视网膜及视神经，挥发性吸入时给人带来恶心难受感觉。其毒性、麻醉性以及对上呼吸道黏膜的刺激都比乙醇强。接触高浓度蒸气出现头痛、倦睡以及眼、鼻、喉刺激症状。食入或吸入大量的蒸汽可引起面红、头疼、精神抑郁、恶心、昏迷等。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种简单有效的细菌核酸提取用裂解结合液，还提供包含该裂解结合液的细菌核酸提取试剂盒。
[0006]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]1.一种核酸提取用裂解结合液，所述裂解结合液由以下物质组成：盐酸胍，EDTA，tritonX
‑
100，Tris
‑
HCl，NP
‑
40，CTAB，水。
[0008]进一步，所述裂解结合液由以下物质组成：3
‑
6M盐酸胍，5
‑
20mM EDTA，1
‑
20％TritonX
‑
100，0.1
‑
1M Tris
‑
HCl，0.5
‑
2％NP
‑
40，0.1
‑
0.5％CTAB，余量为水。
[0009]进一步，所述裂解结合液由以下物质组成：4M盐酸胍，5mM EDTA，10％TritonX
‑
100，0.7M Tris
‑
HCl，1％NP
‑
40，0.1％CTAB，余量为水。
[0010]进一步，所述裂解结合液还包括3％
‑
8％磁珠。
[0011]进一步，所述裂解结合液pH值6.0
‑
6.5。
[0012]2.任意项上述的核酸提取用裂解结合液在制备核酸提取的试剂或试剂盒中的应用。
[0013]3.含有任意项上述的核酸提取用裂解结合液的核酸提取试剂盒，所述核酸提取试剂盒包括蛋白酶K溶液、裂解结合液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。
[0014]进一步，所述蛋白酶K溶液浓度为10
‑
30mg/ml。
[0015]进一步，洗涤缓冲液包括洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2，洗涤缓冲液1由以下组分组成：0.5
‑
2M盐酸胍，10mM Tris
‑
HCl，0.1
‑
1M NaCl，pH值6.0
‑
6.5，30
‑
60％乙醇溶液；洗涤缓冲液2为70
‑
85％乙醇水溶液。
[0016]进一步，洗脱缓冲液由以下组分组成：1
‑
5mM EDTA，5
‑
20mM Tris
‑
HCl，pH值7.0
‑
10。
[0017]4.使用上述任意项核酸提取试剂盒提取核酸的提取方法，具体步骤如下：
[0018]1)在生物样品中加入裂解结合液，再加入蛋白酶K，在70
‑
95℃裂解5
‑
15min，生物样品释放出核酸，在裂解结合液下与磁珠结合，在外部磁场作用下，磁珠聚集，形成磁珠
‑
核酸复合物，收集磁珠
‑
核酸复合物；
[0019]2)向磁珠
‑
核酸复合物中加入洗涤缓冲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸提取用裂解结合液，其特征在于，所述裂解结合液由以下物质组成：盐酸胍，EDTA，tritonX
‑
100，Tris
‑
HCl，NP
‑
40，CTAB，水。2.根据权利要求1所述的核酸提取用裂解结合液，其特征在于，所述裂解结合液由以下物质组成：3
‑
6M盐酸胍，5
‑
20mM EDTA，1
‑
20％TritonX
‑
100，0.1
‑
1M Tris
‑
HCl，0.5
‑
2％NP
‑
40，0.1
‑
0.5％CTAB，余量为水。3.根据权利要求1所述的核酸提取用裂解结合液，其特征在于，所述裂解结合液由以下物质组成：4M盐酸胍，5mM EDTA，10％TritonX
‑
100，0.7M Tris
‑
HCl，1％NP
‑
40，0.1％CTAB，余量为水。4.根据权利要求1～3任意项所述的核酸提取用裂解结合液，其特征在于，所述裂解结合液还包括3％
‑
8％磁珠。5.权利要求1～4任意项所述的核酸提取用裂解结合液在制备核酸提取的试剂或试剂盒中的应用。6.含有权利要求1～4任意项所述的核酸提取用裂解结合液的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂盒包括蛋白酶k溶液、裂解结合液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。7.根据权利要求6所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，洗涤缓冲液包括洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2，洗涤缓冲液1由以下组分组成...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈江坡，马蒙蒙，胖铁良，孙杰，张志达，陈传红，王文轩，
申请(专利权)人：北京中科医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：