一种杨树遗传转化方法技术

本发明专利技术涉及植物基因工程技术领域，公开了一种以杨树叶柄为外植体进行农杆菌侵染的高效遗传转化方法。本发明专利技术选择美洲黑杨和欧美杨的杂交种为实验材料，通过农杆菌介导法将pCAMBIA1301载体转化NL895外植体。对本发明专利技术以叶柄为外植体和以叶片为外植体的对照组进行侵染后的转化效率进行比较，发现以叶柄为外植体转化效率高达80.6％，比传统方法以叶片为外植体进行侵染转化效率提高5倍以上。首次公开了以NL895叶柄为外植体进行农杆菌侵染的方法，建立了一套针对NL895叶柄的杨树高效遗传转化完整体系，与选择叶片为外植体的传统方法相比转化效率有大幅度提高，同时可以提高分子育种效率，也可以为杨树转基因材料的创制和重要性状基因的功能验证提供了重要工具。要性状基因的功能验证提供了重要工具。要性状基因的功能验证提供了重要工具。

【技术实现步骤摘要】
一种杨树遗传转化方法


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，涉及一种以杨树良种NL895叶柄为外植体进行农杆菌侵染的高效的杨树遗传转化方法。

技术介绍

[0002]杨树(Populus spp.)世界上分布最广、栽培面积最大的速生用材树种之一，是环境绿化的重要的树种。杨树也是全球第一个完成全基因组测序的木本植物，已被广泛用做木本植物基因功能研究和分子育种设计的模式树种。“南林895”(Populus deltoides
×
P.euramericana
‘
NL895
’
)是南京林业大学以美洲黑杨(Populus deltoides)为母本，欧美杨(Populus euramericana cv)为父本杂交选育而成的优良无性系，其材质优良，木材产量高，在生产上大面积推广。NL895易于无性繁殖，是应用较为广泛的林木转基因受体材料，成为木本植物遗传基础研究的模式体系之一。建立高效的遗传转化体系是开展杨树基因功能研究和进行分子育种设计的基础。杨树遗传转化普遍以叶片为外植体，NL895现有的遗传转化体系转化效率仅有12％左右，较低的转化效率限制了其做为模式体系的推广与的应用。随着基因编辑技术等在木本植物基因功能研究和分子育种设计中的应用，建立NL895高效遗传转化体系，对以杨树为代表的林木基因功能研究及新品种创制具有重要意义。

技术实现思路

[0003]针对现有技术存在的杨树遗传转化效率低的问题，本专利技术所要解决的技术问题在于杨树遗传转化效率，尤其是提高杨树NL895遗传转化效率。本专利技术提供了一种以NL895叶柄为外植体新的遗传转化方法，极显著的提高转化效率，为以杨树为代表的林木基因功能研究及新品种创制提供技术支持。
[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0005](1)预培养
[0006]预培养采用表1分化培养基，取NL895长势良好的组培苗为实验材料，剪取倒2
‑
4片展开叶叶柄作为外植体置于分化培养基进行预培养2天，同时保留叶柄端部的叶片，剪去叶片四周边缘作为对照进行同步操作。
[0007]表1 NL895培养基组成
[0008][0009](2)重悬液制备
[0010]将已经鉴定的含有pCAMBIA1301载体的农杆菌单克隆菌落接种到含有卡那霉素(Kanamycin/Kan，50mg/L)和利福平(Rifampicin/Rif，20mg/L)的10mL液体Luria
‑
Bertani(LB)培养基制备成小摇液，28℃，200rpm震荡培养48h，吸取1mL小摇液接种到50mL含有Kan(50mg/L)和Rif(20mg/L)的液体LB培养基制备成大摇液，培养4
‑
6h至OD600≈0.5，5000rpm离心15min收集菌体，将菌体用50mL含有乙酰丁香酮(Acetosyringone/AS，100μM)的重悬液稀释，制备成侵染液用于侵染。
[0011](3)共培养
[0012]共培养采用表1分化培养基加AS(100μM)。将步骤(1)预培养的叶柄浸入步骤(2)重悬液中浸泡25min左右，期间不断轻轻摇晃，然后将浸泡后的叶柄用无菌纸吸干，置于共培养培养基，在25℃培养室暗培养2天。
[0013](4)光照培养
[0014]光照培养采用表1分化培养基加Cef(200mg/L)和特美汀(Timentin/Tim，150mg/L)，将步骤(3)共培养的叶柄浸入加有Cef(200mg/L)的无菌水中浸泡5min，取出用无菌纸吸干，置于光照培养基，在25℃培养室光照培养7天。
[0015](5)筛选培养
[0016]筛选培养采用表1分化培养基加Cef(200mg/L)、Tim(150mg/L)和Kan(50mg/L)。将步骤(4)光照培养的叶柄转移到筛选培养基培养至分化出愈伤组织，此阶段生长周期为40
天左右，每隔10天更换一次筛选培养基。
[0017](6)抗性芽筛选
[0018]抗性芽筛选培养采用表1芽伸长培养基加Cef(200mg/L)、Tim(150mg/L)和Kan(50mg/L)。将步骤(5)筛选培养的叶柄分化后的愈伤组织切下转移到抗性芽筛选培养基，直至长成不定芽。
[0019](7)抗性苗筛选
[0020]抗性苗筛选培养采用表1生根培养基加Tim(150mg/L)。将步骤(6)长大的抗性芽分成单株转移到抗性苗筛选培养基，直至长成小苗。
[0021](8)抗性苗鉴定
[0022]以pCAMBIA1301载体卡那霉素抗性基因(Kanamycin resistant gene)序列为模板设计引物，pCAMBIA1301
‑
Kan
‑
F：CGATACCGTAAAGCACGAGGAAG；pCAMBIA1301
‑
Kan
‑
R：TCACTGAAGCGGGAAGGGACT。选取生根良好的抗性苗提取DNA进行分子检测计算转化效率。
[0023](9)转化效率统计分析
[0024]每簇芽分出的小苗按一个株系计算，抗性苗的株系数与步骤(1)预培养的外植体数量的比例为转化效率。结果显示以叶柄为外植体进行农杆菌侵染转化效率为80.6％，而以叶片为外植体进行农杆菌侵染转化效率为12.2％。因此，本专利技术获得了以杨树叶柄为外植体的高效遗传转化方法。
[0025]有益效果：相比于现有技术，本专利技术的优点为：
[0026]本专利技术通过以长势良好的NL895组培苗的叶柄为外植体进行农杆菌侵染，通过六个批次的重复实验，每个批次选择的叶柄和叶片外植体数目均大于40个，最后结合PCR的分子检测结果统计转化效率(表2)。结果显示本专利技术中以杨树叶柄为外植体进行农杆菌侵染转化效率为80.6％，而对照是以传统方法选择叶片为外植体的转化效率为12.2％，以叶柄为外植体进行农杆菌侵染转化效率相比传统方法提高5倍以上，极大的克服了现有技术的不足，为NL895转基因材料的创制和重要性状基因的功能验证提供了重要工具，将极大提高分子育种效率。
附图说明
[0027]图1为pCAMBIA1301载体结构示意图；
[0028]图2为以NL895叶柄和叶片为外植体侵染后分化至产生抗性苗对照图；
[0029]图3为以NL895叶柄和叶片为外植体转化效率对比图；
[0030]图4为抗性植株分子检测PCR扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶中的电泳图。
具体实施方式
[0031]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规实验方法；
[0032]下述实施例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径购买得到。
[0033]下面结合具体实施例对本专利技术做进一步描述。
[0034]实施例1：
[0035]1、pCAMBIA1301载体由本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以杨树叶柄为外植体的遗传转化方法，包括以下步骤：(1)选择长势良好的美洲黑杨和欧美杨的杂交种无性系NL895组培苗为实验材料，剪取倒2
‑
4片展开叶叶柄作为外植体，用侵染液进行侵染；(2)侵染完成共培养2天后，将外植体在加有头孢羟氨苄(Cefadroxil/Cef，200mg/L)的无菌水中浸泡1
‑
10min，取出，用无菌纸吸干，置于分化培养基，在25℃培养室光照培养5
‑
10天，然后进行筛选培养；(3)筛选培养待外植体分化产生愈伤组织，用手术刀将愈伤组织切下转移到芽伸长培养基，直至长出抗性不定芽；(4)抗性不定芽生长到0.5
‑
2cm，分成单株转移到生根培养基，直至长成完整植株；(5)以pCAMBIA1301载体卡那霉素抗性基因(Kanamycin resistant gene)序列为模板设计引物，pCAMBIA1301
‑
Kan
‑
F：CGATACCGTAAAGCACGAGGAAG；pCAMBIA1301
‑
Kan
‑
R：TCACTGAAGCGGGAAGGGACT，选取生根良好的抗性苗提取DNA进行分子检测计算转化效率。2.权利要求1所述方法，其特征在于，所述分化培养基的组成包括MS 4.43g/L、蔗糖30g/L、6
‑
BA 0.5mg/L、TDZ 0.004mg/L、国产琼脂粉8g/L或进口琼脂粉6g/L或PHTAGEL 2.5g/L，所述分化培养基的pH值为5.80
‑
5.85。3.权利要求1所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：周芳伟，李淑娴，尹佟明，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：