本发明专利技术公开了一种来源于南极细菌的耐低温磷脂酶D及其制备方法和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；该耐低温磷脂酶D基因序列如SEQ IDNO:2所示。本发明专利技术获得一株耐低温磷脂酶D的大肠杆菌重组表达菌株，利用该菌株，可实现重组蛋白大量可溶性表达，易于后期纯化及蛋白获得。本发明专利技术的表达产物具备有良好的低温储藏稳定性和良好的酶活力，同时对有机溶剂和表面活性剂有一定的耐受性。本发明专利技术获得磷脂酶D可适用于磷脂改性，生产磷脂酸及各类天然稀有磷脂和非天然磷脂化合物，应用于生物、食品、医药、化妆品、农业、工业等领域。工业等领域。
【技术实现步骤摘要】
一种来源于南极细菌的耐低温磷脂酶D及其制备方法和应用
[0001]本专利技术属于酶的基因工程
，具体的说，涉及一种优化的南极细菌来源的耐低温磷脂酶D重组大肠杆菌菌株及酶蛋白制备方法；本专利技术还涉及所表达的耐低温磷脂酶D的应用。
技术介绍
[0002]磷脂酶D(Phospholipase D，PLD，EC3.1.4.4)是一类水解磷脂结构中的磷酸二酯键生成磷脂酸(PA)和相应含羟基化合物的酶。PLD可通过其水解产物PA发挥第二信使功能并参与多种生理活动，如细胞增殖、炎症、病毒感染等，也能导致神经退行性疾病、人类癌症和植物应激反应。除此之外，磷脂酶D也可以催化转磷脂酰基反应，合成具有生理功能的磷脂衍生物，如磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)等。因此，作为一类重要的工具酶，PLD在磷脂改性中发挥着重要作用，在食品、医药和化妆品行业中具有极大的应用价值。
[0003]目前，限制磷脂酶D得以广泛应用的主要原因有以下几点：一是商品化磷脂酶D来源范围较窄，种类少。国际上商品化磷脂酶D主要被日本天野公司所垄断，且其来源大多为链霉菌属，种类稀少，价格昂贵。国内对磷脂酶D的研究也才刚刚起步，还未开发出商品化PLD。二是现已报道的磷脂酶D的表达量和酶活力都普遍较低。天然磷脂酶D难以提取纯化，且获得的产量较低，生产成本高，难以工业化生产。而基因工程菌异源表达的磷脂酶D主要以包涵体形式存在且酶活力较低，从而限制了磷脂酶D的规模化制备。三是报道的大多数磷脂酶D在低温下酶活力会被抑制，且储藏期较短，这严重影响了该酶的应用和保存。因此，开发一种高表达高活力的低温稳定性磷脂酶D具有重要意义。
技术实现思路
[0004]为解决现有技术的缺点和不足之处，本专利技术的目的在于提供一种南极细菌来源的耐低温磷脂酶D及其制备方法。
[0005]本专利技术的第一个方面公开了一种来自南极细菌(Moritella sp.JT01)的耐低温磷脂酶D，其含有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
[0006]本专利技术的另一个方面，提供了一种编码上述磷脂酶D的优化的核酸序列，获得在大肠杆菌高表达的耐低温磷脂酶D，具有如SEQ ID NO：2所示的核酸序列。
[0007]本专利技术的第三个方面，提供了一种重组表达载体，其包含上述多核苷酸。
[0008]本专利技术的第四个方面，提供了一种细胞，其包含上述载体，或其基因组中整合有上述多核苷酸。
[0009]本专利技术的第五个方面，表征了上述磷脂酶D的酶学性质。
[0010]本专利技术的第六个方面，提供了一种生产上述磷脂酶D的方法，包括：培养上述宿主细胞，从培养物中纯化出表达产物。
[0011]本专利技术的第七个方面，提供了上述磷脂酶D的用途，可应用于磷脂改性中。
[0012]本专利技术的技术方案具体如下：
[0013]一种来源于南极细菌的耐低温磷脂酶D，是在对NCBI数据库中提供的南极细菌(Moritella sp.JT01)磷脂酶D完整蛋白序列(GenBank:KXO13223.1)基础上去除N端28个氨基酸基础上获得(命名为MsPLD)，其氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。
[0014]一种低温磷脂酶D基因，是在对NCBI数据库中提供的南极细菌(Moritella sp.JT01)磷脂酶D(GenBank:LOCN01000006.1)基因序列(SEQ ID NO:1)进行优化的基础上获得，优化后的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0015]一种耐低温磷脂酶D重组菌株的制备方法，包括如下步骤：
[0016](1)将权利要求2所述耐低温磷脂酶D基因克隆到pET
‑
21a表达载体上，构建得到重组质粒；
[0017](2)将所得的重组质粒转化大肠杆菌Shuffle T7感受态细胞，挑选阳性克隆，获得重组大肠杆菌表达菌株。
[0018]一种重组耐低温磷脂酶D的制备方法，以上述获得的重组大肠杆菌表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，制得重组耐低温磷脂酶D。具体步骤如下：
[0019](1)将重组大肠杆菌表达菌株接种于含氨苄青霉素的种子培养基中，于37
±
2℃，摇瓶培养至对数生长期，制备种子液；
[0020](2)将所述种子液按5～10％的接种量接种到LB液体发酵培养基中，于37
±
2℃，摇瓶培养至OD600＝0.6～0.8，再添加IPTG至终浓度0.2mM，于16
‑
20℃，摇瓶条件下诱导培养；
[0021](3)将步骤(2)中所得发酵液离心，收集菌体沉淀，用缓冲液重悬并超声破碎细胞，将细胞破碎液离心，取上清，即为重组耐低温磷脂酶D粗酶液。
[0022]优选地，将步骤(3)所得重组耐低温磷脂酶D粗酶液，分别经镍柱亲和层析、G
‑
25脱盐柱纯化获得电泳纯的重组耐低温磷脂酶D酶液。
[0023]优选地，步骤(3)重悬的缓冲液为50mM Tris
‑
HCl，500mM NaCl，pH8.0；所述镍柱亲和层析所用的洗脱缓冲液为含有300mM咪唑的50mM Tris
‑
HCl，500mM NaCl，pH8.0；G
‑
25脱盐柱纯化中所用的洗脱缓冲液为50mM Tris
‑
HCl，500mM NaCl，pH8.0。
[0024]上述耐低温磷脂酶D用于催化合成磷脂酸或磷脂衍生物。
[0025]与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：
[0026](1)本专利技术获得的MsPLD是首个南极细菌来源的具有耐低温且低温储藏期较长的高表达磷脂酶D。MsPLD在35℃，pH8.0表现出最适反应酶活力，该酶在4℃条件下，放置18天，其酶活力仍保持70％以上。根据该酶的酶失活曲线，可知其在4℃的半衰期能长达41天。此外，该酶对50％有机溶剂(N
‑
正己烷、苯、乙醚)和2％(v/v)表面活性剂(吐温
‑
20、吐温
‑
80、曲拉通X
‑
100、司班
‑
80)有较强的耐受性，处理2h后的残余酶活力均在80％以上。
[0027](2)本专利技术制备所得的MsPLD具有水解PC和LPC等磷脂的活性，可用于水解磷脂酰胆碱制备磷脂酸(PA)，也能应用于磷脂的头部改性制备具有生理功能的磷脂衍生物，例如磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)等。采用所述方法得到的重组磷脂酶D，具有较高的表达量，且在低温下具有良好的酶活力和储藏稳定性。因此，MsPLD可作为磷脂酶D催化剂，应用于生物、食品、医药、化妆品等领域中。
Tris
‑
HCl(pH8.0)，5mM soyPC，15mM SDS，15mM Tritonx
‑
100和10μL纯化后的酶溶液，于各温度下反应5min，加热本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种来源于南极细菌的耐低温磷脂酶D，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。2.一种耐低温磷脂酶D基因，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO:2所示。3.包含权利要求2所述磷脂酶D基因的表达载体。4.一种细胞，包含权利要求3所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的磷脂酶D基因。5.一种耐低温磷脂酶D重组菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将权利要求2所述耐低温磷脂酶D基因克隆到pET
‑
21a表达载体上，构建得到重组质粒；(2)将所得的重组质粒转化大肠杆菌Shuffle T7感受态细胞，挑选阳性克隆，获得重组大肠杆菌表达菌株。6.一种重组耐低温磷脂酶D的制备方法，其特征在于，以权利要求5获得的重组大肠杆菌表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，制得重组耐低温磷脂酶D。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)将重组大肠杆菌表达菌株接种于含氨苄青霉素的种子培养基中，于37
±
2℃，摇瓶培养至对数生长期，制备种子液；(2)将所述种子液按5～10％的接种量接种到LB液体发酵培养基中，于37
±
...
【专利技术属性】
技术研发人员：王永华，王方华，刘思雨，杨博，蓝东明，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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