一种肺癌基因突变位点的检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术提供一种肺癌基因突变位点的检测方法及其试剂盒，所述检测方法包括：首先，制备得到数字PCR混合液，所述数字PCR混合液不包含三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸，所述数字PCR使用的引物包含不少于十三个碱基的核酸序列N；其次，用数字PCR混合液进行PCR扩增反应，得到PCR扩增反应后的产物；最后，根据荧光信号的类型判断待测样品中是否含有目标基因的位点突变的DNA模板及其数量和突变丰度。本发明专利技术独特的超多重数字PCR技术大幅提高了肿瘤基因检测的信息通量，可以在2个反应体系内扩增多达99重位点，避免了由于样本分管造成的灵敏度降低的问题，同时检测位点数的提升使检测的临床意义大幅提升。幅提升。幅提升。

【技术实现步骤摘要】
一种肺癌基因突变位点的检测方法及其试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种肺癌基因突变位点的检测方法及其试剂盒。

技术介绍

[0002]传统的PCR技术手段容易产生非特异性扩增。为了避免非特异性扩增对结果信噪比和特异性的影响，目前PCR体系内扩增重数限制在10重以内。目前临床上需要检测的肿瘤突变位点有近千个，几乎以NGS平台为主。目前基于PCR的肿瘤基因检测产品由于扩增重数的限制，仅覆盖少量位点，而且需要在多个反应体系内(如艾德生物需使用12个反应体系)完成。多个反应体系内完成检测导致了对同一患者临床样本的稀释，最终降低了检测的灵敏度。因此，有必要提供改进的技术方案以克服现有技术中存在的技术问题。

技术实现思路

[0003]为解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种肺癌基因突变位点的检测方法及试剂盒，采用数字PCR的技术手段，应用适应肺癌基因突变位点检测的缓冲液和引物，进行选定肺癌基因突变位点的检测。本专利技术独特的超多重数字PCR技术大幅提高了肿瘤基因检测的信息通量，可以在2个反应体系内扩增多达99重位点，避免了由于样本分管造成的灵敏度降低的问题，同时检测位点数的提升使检测的临床意义大幅提升。
[0004]本专利技术第一方面提供一种肺癌基因突变位点的检测方法，所述检测方法包括：步骤一、制备得到数字PCR混合液；其中，所述数字PCR混合液不包含三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸，所述数字PCR使用的引物包含三维结构，所述数字PCR使用的引物包含不少于十三个碱基的核酸序列N；所述数字PCR使用的引物包含如下核酸序列：GGGUUGGGAAGAAACUGUGGCACUUCGGUGCCAGCAACCC；将所述数字PCR使用的引物进行预处理，所述预处理方法包括：将所述数字PCR使用的引物加入到缓冲液中加热至65～85℃，保温5～10分钟，然后冷却至0～40℃，保温20～30分钟；步骤二、用数字PCR混合液制作PCR微反应单元，再进行PCR扩增反应，得到PCR扩增反应后的产物；步骤三、对所述PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号的类型判断待测样品中是否含有目标基因的位点突变的DNA模板及其数量和含量。通过上述技术方案，应用适应肺癌基因突变位点检测的引物设计，进行选定肺癌基因突变位点的检测。本专利技术独特的超多重数字PCR技术大幅提高了肿瘤基因检测的信息通量，可以在2个反应体系内扩增多达99重位点，避免了由于样本分管造成的灵敏度降低的问题，同时检测位点数的提升使检测的临床意义大幅提升。
[0005]优选地，在如前所述的检测方法中，所述缓冲液的组分为：300
±
5mM NaCl，4.5
±
1mM MgCl2，20
±
5mM Tris(pH 7.6)。通过该技术方案，应用适应肺癌基因突变位点检测的缓冲液和引物设计，进行选定肺癌基因突变位点的检测。本专利技术独特的超多重数字PCR技术大幅提高了肿瘤基因检测的信息通量，可以在2个反应体系内扩增多达99重位点，避免了由于样本分管造成的灵敏度降低的问题，同时检测位点数的提升使检测的临床意义大幅提升。
[0006]优选地，在如前所述的检测方法中，所述核酸序列N只由碱基A、T和G组成。通过该技术方案，应用适应肺癌基因突变位点检测的缓冲液和引物设计，进行选定肺癌基因突变位点的检测。本专利技术独特的超多重数字PCR技术大幅提高了肿瘤基因检测的信息通量，可以在2个反应体系内扩增多达99重位点，避免了由于样本分管造成的灵敏度降低的问题，同时检测位点数的提升使检测的临床意义大幅提升。
[0007]优选地，在如前所述的检测方法中，步骤二所述数字PCR可在至少2个反应体系中扩增至少99重位点。通过该技术方案，应用适应肺癌基因突变位点检测的缓冲液和引物设计，进行选定肺癌基因突变位点的检测。本专利技术独特的超多重数字PCR技术大幅提高了肿瘤基因检测的信息通量，可以在2个反应体系内扩增多达99重位点，避免了由于样本分管造成的灵敏度降低的问题，同时检测位点数的提升使检测的临床意义大幅提升。
[0008]本专利技术第二方面提供一种肺癌基因突变位点的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒通过数字PCR完成肺癌基因突变位点的检测，所述检测试剂盒使用的引物包含不少于十三个碱基的特殊核酸序列N，所述特殊核酸序列N只由碱基A、T和G组成。通过上述技术方案，应用适应肺癌基因突变位点检测的引物设计，进行选定肺癌基因突变位点的检测。本专利技术独特的超多重数字PCR技术大幅提高了肿瘤基因检测的信息通量，可以在2个反应体系内扩增多达99重位点，避免了由于样本分管造成的灵敏度降低的问题，同时检测位点数的提升使检测的临床意义大幅提升。
[0009]优选地，在如前所述的检测试剂盒中，所述检测试剂盒使用的反应液不包含三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸组分。通过该技术方案，应用适应肺癌基因突变位点检测的缓冲液和引物设计，进行选定肺癌基因突变位点的检测。本专利技术独特的超多重数字PCR技术大幅提高了肿瘤基因检测的信息通量，可以在2个反应体系内扩增多达99重位点，避免了由于样本分管造成的灵敏度降低的问题，同时检测位点数的提升使检测的临床意义大幅提升。
[0010]优选地，在如前所述的检测试剂盒中，所述检测试剂盒可在至少2个反应体系中使用至少99对引物，同时进行目标序列的检测。
[0011]本专利技术第三方面提供一种所述的检测方法在生物或医药领域的应用。
[0012]本专利技术第四方面提供一种所述的检测试剂盒在生物或医药领域的应用。
[0013]本专利技术创造的有益效果：本专利技术提供一种肺癌基因突变位点的检测方法及试剂盒，采用数字PCR的技术手段，应用适应肺癌基因突变位点检测的缓冲液和引物，进行选定肺癌基因突变位点的检测，使用超多重数字PCR技术大幅提高了肿瘤基因检测的信息通量，可以在2个反应体系内扩增多达99重位点，避免了由于样本分管造成的灵敏度降低的问题，同时检测位点数的提升使检测的临床意义大幅提升。
附图说明
[0014]为了更清楚地说明本专利技术的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0015]图1为本专利技术检测的目标基因的突变位点；图2为本专利技术检测的肺癌基因位点突变位点的聚类分析。
具体实施方式
[0016]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。
[0017]可对本专利技术提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
[0018]在本专利技术中，如果没有特别的说明，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肺癌基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：步骤一、制备得到数字PCR混合液；其中，所述数字PCR混合液不包含三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸，所述数字PCR使用的引物包含三维结构，所述数字PCR使用的引物包含不少于十三个碱基的核酸序列N；所述数字PCR使用的引物包含如下核酸序列：GGGUUGGGAAGAAACUGUGGCACUUCGGUGCCAGCAACCC；将所述数字PCR使用的引物进行预处理，所述预处理方法包括：将所述数字PCR使用的引物加入到缓冲液中加热至65~85℃，保温5~10分钟，然后冷却至0~40℃，保温20~30分钟；步骤二、用数字PCR混合液制作PCR微反应单元，再进行PCR扩增反应，得到PCR扩增反应后的产物；步骤三、对所述PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号的类型判断待测样品中是否含有目标基因的位点突变的DNA模板及其数量和含量。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲液的组分为：300
±
5 mM NaCl，4.5<...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚午，张毅良，
申请(专利权)人：南京普济生物有限公司，
类型：发明
国别省市：