一种同源重组高效的鞘茎点霉属的基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种同源重组高效的鞘茎点霉属的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术的目的是为了解决如何提高Coleophoma sp.同源重组效率的问题。本发明专利技术提供的一种利用ku80基因缺失提高同源重组效率的Coleophoma sp.基因工程菌，以其为出发菌，将打靶元件中的外源基因以同源重组的方式定点整合到基因组上，同源重组效率达到90％以上，为基因打靶技术在丝状真菌中的应用提供了好的理论基础。好的理论基础。好的理论基础。

【技术实现步骤摘要】
一种同源重组高效的鞘茎点霉属的基因工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种同源重组高效的鞘茎点霉属的基因工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]环脂肽类化合物是一种重要的微生物天然产物，被报道具有多种生物活性，被开发成为抗真菌药物、免疫抑制剂等多种药物。鞘茎点霉属真菌(Coleophoma sp.)被报道能够合成环脂肽类化合物，但是由于同源重组效率低，使得基因打靶等遗传改造难度大，限制了环脂肽类化合物合成机制解析和代谢工程改造。开发一种遗传改造高效的Coleophoma sp.底盘细胞及其方法具有重要应用价值。
[0003]基因打靶技术是现代分子生物学的一个重要研究手段，通常是指利用同源重组的方法将含已知序列的外源DNA片段与生物体基因组发生结合，整合至受体染色体特异性靶位点上。该技术可增加外源DNA片段，或者删除同源臂之间DNA片段，可以用于基因敲除、基因替换和外源基因定点过表达等多种遗传改造。因此，基因打靶技术在代谢工程改造研究中发挥着非常重要的作用。在丝状真菌中DNA双链断裂修复主要依靠非同源末端连接途径 (Non
‑
homologous End Joining，NHEJ)，导致外源DNA主要以随机插入方式整合至基因组染色体上，同源重组效率低下，严重制约了基因打靶技术在丝状真菌中的应用。因此一种高效的基因打靶技术将可以为Coleophoma sp.中环脂肽类化合物生物合成途径研究以及菌株基因工程改造提供重要技术支持。
专利技术内容
[0004]本专利技术的目的是为了解决如何提鞘茎点霉属真菌(Coleophoma sp.)基因打靶效率的问题，为了解决上述的技术问题，本专利技术提供了一种同源重组高效的鞘茎点霉属(Coleophomasp.)的基因工程菌，所述基因工程菌是通过失活出发菌中非同源末端连接途径所得到的基因工程菌。
[0005]进一步地限定，所述基因工程菌是以鞘茎点霉属真菌(Coleophoma sp.)为出发菌，通过失活出发菌中ku80基因所得到的基因工程菌Coleophoma sp.
‑△
ku80。
[0006]进一步地限定，所述ku80基因序列如SEQ ID NO.15所示。
[0007]本专利技术还提供了上述的同源重组高效的鞘茎点霉属的基因工程菌的构建方法，所述构建方法是敲除鞘茎点霉属真菌(Coleophoma sp.)非同源末端连接途径中的关键基因。
[0008]进一步地限定，所述关键基因是ku80基因，所述构建方法的具体步骤如下：
[0009](1)构建ku80打靶元件：以Coleophoma sp.的基因组为模板，用PCR扩增获得ku80 的上游序列Uku80和下游序列Dku80，然后以pXH2
‑
1为模板，通过PCR扩增出hph片段；通过融合PCR将上游序列Uku80、下游序列Dku80和hph片段进行融合，再以融合产物作为模板，扩增出打靶元件Uku80
‑
hph
‑
Dku80；
[0010](2)将步骤(1)得到的ku80打靶元件转化到Coleophoma sp.的原生质体中，用潮霉素抗性筛选及基因组验证后获得敲除ku80基因的基因工程菌Coleophoma sp.
‑△
ku80。
[0011]进一步地限定，步骤(1)中扩增ku80的上游序列Uku80的引物为Uku80
‑
F：5
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tgcgcgtctgaaatggacac
‑3’
和Uku80
‑
R1：5
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ctttacgcttgcgatcccgaaGGCCATCTGTAACAAGAATAA
‑3’
；所述扩增ku80的下游序列Dku80 的引物为Dku80
‑
F1：5
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ccctgggttcgcaaagataattgCGAGATACAATTACGCCACT
‑3’
和 Dku80
‑
R：5
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cctcggaatgtctccagaag
‑3’
；所述扩增hph片段的引物为hph
‑
F：5
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ttcgggatcgcaagcgtaaag
‑3’
和hph
‑
R：5
’‑
caattatctttgcgaacccagg
‑3’
；所述扩增Uku80
‑
hph
‑
Dku80 的巢式引物为Uku80
‑
CS
‑
F：5
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tgccattaaggtacctgtgc
‑3’
和Dku80
‑
CS
‑
R：5
’ꢀ‑
accagatcgacctttagctg
‑3’
。
[0012]本专利技术还提供了一种上述的同源重组高效的鞘茎点霉属的基因工程菌在提高基因打靶效率中的应用，所述应用是以上述的同源重组高效的鞘茎点霉属的基因工程菌为出发菌，将外源基因导入到出发菌中，将外源基因以同源重组的方式整合到基因组上。
[0013]进一步地限定，所述整合基因组为替换ku80基因位点上的抗性基因，所述应用的具体步骤如下：
[0014](1)如上述同源重组高效的鞘茎点霉属的基因工程菌的构建方法得到同源重组高效的基因工程菌Coleophoma sp.
‑△
ku80；
[0015](2)构建以抗性基因neo作为筛选标记的ku80位点抗性基因替换元件：以Coleophoma sp.的基因组为模板，用PCR扩增获得ku80的上游序列Uku80
‑
2和下游序列Dku80
‑
2，将 Uku80
‑
2、Dku80
‑
2和表达盒Ppgk
‑
neo
‑
Tpgk进行融合，然后以融合产物为模板，用PCR扩增获得Uku80
‑
neo
‑
Dku80片段，作为外源基因打靶元件；
[0016](3)将步骤(2)得到的Uku80
‑
neo
‑
Dku80打靶元件导入到步骤(1)得到的基因工程菌Coleophoma sp.
‑△
ku80中。
[0017]进一步地限定，步骤(2)中扩增ku80的上游序列Uku80
‑
2的引物为Uku80
‑
F：5
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和Uku80
‑
R2：5
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ggggcttttccttctctagaGGC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同源重组高效的鞘茎点霉属(Coleophoma sp.)的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是通过失活出发菌中非同源末端连接途径所得到的基因工程菌。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以鞘茎点霉属真菌(Coleophoma sp.)为出发菌，通过失活出发菌中ku80基因所得到的基因工程菌Coleophoma sp.
‑△
ku80。3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述ku80基因序列如SEQ ID NO.15所示。4.如权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法是敲除鞘茎点霉属真菌(Coleophoma sp.)非同源末端连接途径中的关键基因。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述关键基因是ku80基因；所述构建方法的具体步骤如下：(1)构建ku80打靶元件：以Coleophoma sp.的基因组为模板，用PCR扩增获得ku80的上游序列Uku80和下游序列Dku80，然后以pXH2
‑
1为模板，通过PCR扩增出hph片段；通过融合PCR将上游序列Uku80、下游序列Dku80和hph片段进行融合，再以融合产物作为模板，扩增出打靶元件Uku80
‑
hph
‑
Dku80；(2)将步骤(1)得到的ku80打靶元件转化到Coleophoma sp.的原生质体中，用潮霉素抗性筛选及基因组验证后获得敲除ku80基因的基因工程菌Coleophoma sp.
‑△
ku80。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中扩增ku80的上游序列Uku80的引物为Uku80
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F：5
’‑
tgcgcgtctgaaatggacac
‑3’
和Uku80
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R1：5
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ctttacgcttgcgatcccgaaGGCCATCTGTAACAAGAATAA
‑3’
；所述扩增ku80的下游序列Dku80的引物为Dku80
‑
F1：5
’‑
ccctgggttcgcaaagataattgCGAGATACAATTACGCCACT
‑3’
和Dku80
‑
R：5
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cctcggaatgtctccagaag
‑3’
；所述扩增hph片段的引物为hph
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F：5
’‑
ttcgggatcgcaagcgtaaag
‑3’
和hph
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R：5
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caattatctttgcgaacccagg
‑3’
；所述扩增Uku80
‑
hph
‑
Dku80的巢式引物为Uku80
‑
CS
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F：5
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tgccattaaggtacctgtgc
‑3’
和Dku80
‑
CS
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R：5
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accagatcgacctttagctg
‑3’
。7.权利要求1
‑
3任意一项所述的基因工程菌在提高基因打靶效率中的应用，其特征在于，所述应用是以权利要求1
‑
3任意一项所述的基因工程菌为出发菌，将外源基因导入到出发菌中，将外源基因以同源重组的方式整合到基因组上。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述整合基因组为替换ku80基因位点上的抗性基因，所述应用的具体步骤如下：(1)如权利要求4或5所述的基因工程菌的构建方法得到同源重组高效的基因工程菌Coleophoma sp.
‑△
ku80；(2)构建以抗性基因neo作为筛选标记的ku80位点抗性基因替换元件：以Coleophoma sp.的基因组为模板，用PCR扩增获得ku80的上游序列U...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕雪峰，门萍，黄雪年，王敏，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：