一种用于负载冠脉支架的细胞外纳米囊泡，制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及细胞培养领域，具体讲，涉及一种用于负载冠脉支架的细胞外纳米囊泡，制备方法和应用。本发明专利技术的用于负载冠脉支架的细胞外纳米囊泡为脐带华通胶源间充质干细胞分泌的。本发明专利技术制备得到的来自脐带华通胶源间充质干细胞的细胞外纳米囊泡具有抗炎、再生和免疫调节功能，促进内皮细胞再生与微环境修复、抑制平滑肌细胞增殖，抗纤维组织增生，促炎症型巨噬细胞向抗炎症的M2转化，保护靶病变内膜完整，实现了血运重建与预防支架内再狭窄及新生动脉粥样硬化和血栓形成的同步化。动脉粥样硬化和血栓形成的同步化。

【技术实现步骤摘要】
一种用于负载冠脉支架的细胞外纳米囊泡，制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及细胞培养领域，具体讲，涉及一种用于负载冠脉支架的细胞外纳米囊泡，制备方法和应用。

技术介绍

[0002]冠心病是威胁人类生命的第一杀手。经皮穿刺冠状动脉介入治疗(PCI)是冠心病治疗的最重要手段。40多年来PCI术器材不断进展，作为PCI核心技术成分
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支架在不断更新。尽管如此，支架置入后再发新冠状动脉粥样硬化(NA)及晚期血栓一直影响PCI术后中远期疗效。
[0003]证据表明，即使应用最新型药物洗脱支架，光学相干断层扫描(OCT)发现仍有27.4％～50％支架内新动脉粥样硬化形成。临床上甚至1/4患者需重复处理支架内新斑块形成所致再狭窄。现硏究发现，二代药物洗脱支架，如佐他莫司洗脱支架、依维莫司洗脱支架等雷帕霉素衍生物药物洗脱支架，或新型无聚合物涂层药物洗脱(西罗莫司、紫杉醇)支架，所产生的抑制内皮细胞、平滑肌细胞增殖的药理效应，却触发了促动脉粥样硬化发病核心机制，即氧化应激产物ROS增多，M1型炎症巨噬细胞激活，大量氧化低密度脂蛋白内膜下堆积及被巨噬细胞吞噬。显著降低细胞骨架衔接蛋白Nck，mTOR、rictor表达和mTORC2的形成，最终导致形成特色的支架内新动脉粥样斑块(Neoatherosclerosis，NA)，其特征为相对较薄的纤维帽和大量的黄色脂质积聚的粥样易损斑块。因此，晚期NA伴内膜破裂和血栓形成是晚期支架血栓形成的最常见机制，也与ST段抬高心肌梗死的高频率发生有关。因此，目前临床迫切需要革新于现有药物洗脱支架的负载物。
[0004]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的首要专利技术目的在于提供一种用于负载冠脉支架的细胞外纳米囊泡。
[0006]本专利技术的第二专利技术目的在于提供该细胞外纳米囊泡在用于制备冠状动脉药物负载支架中的应用。
[0007]本专利技术的第三专利技术目的在于一种冠状动脉药物负载支架。
[0008]本专利技术的第四专利技术目的在于提供该细胞外纳米囊泡的制备方法。
[0009]为了完成本专利技术的专利技术目的，采用的技术方案为：
[0010]本专利技术提出一种用于负载冠脉支架的细胞外纳米囊泡，所述细胞外纳米囊泡为脐带华通胶源间充质干细胞分泌的。
[0011]可选的，所述细胞外纳米囊泡的制剂为冻干粉。
[0012]可选的，所述冻干粉中还含有赋形剂，赋形剂优选甘露醇、山梨醇、葡萄糖、乳糖中的至少一种，细胞外纳米囊泡与赋形剂的重量比为1：50～5000，优选1：100～1000。
[0013]可选的，所述细胞外纳米囊泡为采用采用含有细胞松弛素B的培养基对所述脐带华通胶源间充质干细胞进行处理、然后分离得到。
[0014]可选的，所述细胞松弛素B的浓度为5～20μg/mL，优选10μg/mL；优选的，所述培养基选自DMEM培养基。
[0015]可选的，所述分离选自膜亲和分离法分离；优选采用exoEasy旋转柱进行分离。
[0016]本专利技术还涉及该细胞外纳米囊泡在用于制备冠状动脉药物负载支架中的应用，优选的，所述细胞外纳米囊泡完全替代化学药物负载与所述支架内。
[0017]本专利技术还涉及一种冠状动脉药物负载支架，采用上述细胞外纳米囊泡负载于支架的纳米微孔道中，所述支架选自钴铬合金或铂铬合金。
[0018]本专利技术还涉及该细胞外纳米囊泡的制备方法，至少包括以下步骤：
[0019]S1、获得脐带华通胶源间充质干细胞；
[0020]S2、采用含有细胞松弛素B的培养基对所述脐带华通胶源间充质干细胞进行处理；所述处理温度优选为37℃，时间优选为20～40分钟，
[0021]S3、分离所述细胞外纳米囊泡。
[0022]可选的，所述脐带华通胶源间充质干细胞通过以下方法培养得到：
[0023]S11、取华通胶组织，剪碎后在平皿中进行组织贴壁培养；
[0024]S12、待细胞铺满瓶底80％后，清洗，制成细胞悬液，接种到3D水凝胶中，于37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度条件下扩增培养；
[0025]S13、待细胞融合80％时用水凝胶酶消化、洗涤，传代，取第二、三代细胞在5％低氧细胞培养箱中培养10～18小时。
[0026]本专利技术至少具有以下有益的效果：
[0027]本专利技术制备得到的来自脐带华通胶源间充质干细胞的细胞外纳米囊泡(WJMSCs
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EV)，可用于冠状动脉药物负载支架中，WJMSCs
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EV富含多种生物因子、mRNA和microRNA，具有抗炎、再生和免疫调节功能，促进内皮细胞再生与微环境修复、抑制平滑肌细胞增殖，抗纤维组织增生，促炎症型巨噬细胞向抗炎症的M2转化，保护靶病变内膜完整，这种多靶点协同效应，实现了血运重建与预放支架内再狭窄及新生动脉粥样硬化和血栓形成的同步化。
[0028]本专利技术的来自脐带华通胶源间充质干细胞的细胞外纳米囊泡的制备方法釆用的是细胞松驰剂B联合膜亲和分离法提取WJMSCs
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EV。克服目前采用超速差异离心法提取的剪切力损伤，量少，不易纯化的技术缺陷，本专利技术的制备方法既可获得较多细胞外纳米囊泡又可保持纯度。
[0029]本专利技术的制剂可
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20℃长期保存，常温应用。
[0030]本专利技术的冠状动脉药物负载支架，将制备得到的细胞外纳米囊泡置入支架纳米微孔道储存槽内，均匀控制释放细胞外纳米囊泡，通过与靶血管内皮细胞融合与内化，及进入内皮下细胞间质微环境，发挥物质与信息传递等多靶点生物学效应。
附图说明
[0031]图1为透射电镜下细胞外纳米囊泡形态图像；
[0032]图2为细胞外纳米囊泡提取后经BCA蛋白检测试剂盒检测的标准曲线；
[0033]图3为细胞外纳米囊泡westernblot检测结果；
[0034]图4为光镜下HUVECs；
[0035]图5为HUVECs免疫荧光染色vWF染色；
[0036]图6为HUVECs免疫荧光染色CD31染色；
[0037]图7为WJMSC
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EV与脐静脉来源内膜上皮细胞(HUVECs)共培养，免疫荧光染色CD31+CD9和CD31+CD63共染的结果图；
[0038]图8为HUVECs与WJMSC
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EV共培养后，CCK8方法测定HUVECs增殖率。
具体实施方式
[0039]应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0040]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于负载冠脉支架的细胞外纳米囊泡，其特征在于，所述细胞外纳米囊泡为脐带华通胶源间充质干细胞分泌的。2.根据权利要求1所述的细胞外纳米囊泡，其特征在于，所述细胞外纳米囊泡的制剂为冻干粉。3.根据权利要求2所述的细胞外纳米囊泡，其特征在于，所述冻干粉中还含有赋形剂，赋形剂优选甘露醇、山梨醇、葡萄糖、乳糖中的至少一种，细胞外纳米囊泡与赋形剂的重量比为1：50～5000，优选1：100～1000。4.根据权利要求1所述的细胞外纳米囊泡，其特征在于，所述细胞外纳米囊泡为采用采用含有细胞松弛素B的培养基对所述脐带华通胶源间充质干细胞进行处理、然后分离得到。5.根据权利要求4所述的细胞外纳米囊泡，其特征在于，所述细胞松弛素B的浓度为5～20μg/mL，优选10μg/mL；优选的，所述培养基选自DMEM培养基。6.根据权利要求4所述的细胞外纳米囊泡，其特征在于，所述分离选自膜亲和分离法分离；优选采用exoEasy旋转柱进行分离。7.如权利要求1～6任一项所述的细胞外纳米囊泡在用于制备冠状动脉药物...

【专利技术属性】
技术研发人员：高连如，张宁坤，陈宇，张燕，
申请(专利权)人：高连如，
类型：发明
国别省市：