针对多种HLA-G同种型的嵌合抗原受体制造技术

本发明专利技术涉及针对多种但不是全部人白细胞抗原(HLA

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对多种HLA
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G同种型的嵌合抗原受体


[0001]本专利技术涉及免疫学、细胞生物学和分子生物学领域。在某些方面，本专利技术的领域涉及免疫疗法。更具体地，本专利技术涉及针对多种人白细胞抗原(HLA
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G)同种型的嵌合抗原受体(CAR)。

技术介绍

[0002]多年来，癌症治疗的基础是手术、化学疗法和放射疗法。但是，在过去的几年中，免疫疗法已成为癌症治疗的有效工具。
[0003]基因工程的进步导致了合成的肿瘤靶向受体(称为嵌合抗原受体(CAR))的设计，该受体可以被引入到人免疫细胞(例如T细胞)中，以重定向抗原特异性并增强效应免疫细胞的功能。CAR最早是在1980年代中期开发的，此后人们对这些受体的兴趣不断增长。它们首先被产生以通过独立于HLA
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肽复合物提供特异性抗原识别而绕过表达T细胞的固有的TCR特异性。Eshhar及其同事在1993年的一项研究中首次描述了原型单链CAR，其中T细胞的特异性活化和靶向分别是通过由靶抗原特异性抗体结构域和Fcε受体或T细胞受体CD3复合物的γ或ζ信号传导亚基组成的分子介导的(Eshhar等人,1993,Proc Natl Acad Sci U S A.,90,720
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4)。从那时起，许多研究小组设计出了具有单一肿瘤定向特异性和增强的信号传导胞内结构域的CAR分子。如今，CAR的结合结构域通常由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域或选自文库并包含通过柔性接头连接的单克隆抗体(Mab)的轻链和重链可变片段的抗体结合片段(Fab)组成。scFv保留与衍生其的完整抗体相同的特异性和相似的亲和力，并且能够特异性结合至感兴趣的靶标。因此，CAR在单个融合分子中结合了抗原特异性和T细胞活化特性。实际上，scFv连接至包含CD3ζ的细胞内信号传导模块，以在抗原结合后诱导T细胞活化。模块结构已从仅具有CD3ζ信号传导结构域的第一代CAR扩展到将诸如CD28、4
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1BB或OX40的信号传导胞内结构域连接至CD3ζ的第二代和第三代CAR，以试图模拟共刺激。通常，间隔或铰链结构域用作胞内结构域和scFV之间的接头。此类铰链结构域的掺入改善了柔性、空间组织和/或邻近度，还改善了CAR细胞的扩增(Qin等人，Journal of Hematology&Oncology.2017；10:68)或肿瘤定位(Watanabe等人,Oncoimmunology.2016；5(12):e1253656)。因此，至关重要的是开发包含优化的铰链结构域的CAR。
[0004]CAR允许T细胞以MHC非依赖性机制靶向癌症。CAR的配体结合与TCR对肽/MHC(pMHC)的结合在受体亲和力、抗原密度和空间特性上不同；并且设计针对特定靶分子的最佳CAR的实验方法依赖于体外或人肿瘤异种移植模型中转导的T细胞的功能测定。正如通过TCR/pMHC识别观察到的那样，由于CAR不太可能连续地与靶分子结合并聚集在有组织的突触中，因此可以认为，与TCR相比，CAR识别需要更高的配体密度。除了亲和力和特异性之外，这些受体的最佳构型和应用还依赖于构建体设计、信号传导结构域、载体递送系统、受体免疫细胞群和制造。
[0005]尽管已经进行了许多尝试以实现CAR T细胞成功用于实体瘤，但结果有时令人失望。将CAR T细胞疗法应用于实体瘤遇到的三个主要障碍是(1)适当的肿瘤相关抗原(TAA)
的鉴定，(2)过继转移的细胞向肿瘤部位的有限运输，(3)肿瘤微环境的免疫抑制作用和(4)不想要的或未转化的细胞的潜在安全性问题。
[0006]关于靶标的选择，人白细胞抗原G(HLA
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G)被描述为能够保护胎儿免受其母亲的识别和破坏的免疫系统的侵害的分子，从而提供胎儿
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母亲耐受性。除了其生理功能外，HLA
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G最近还被鉴定为免疫检查点(ICP)分子，其通过与其特定受体的相互作用抑制浸润免疫细胞亚群的效应功能。HLA
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G在具有高度受限的组织表达的多种来源的多种肿瘤积液中表达。在几种恶性转化中，肿瘤细胞的HLA
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G表达急剧上升，使其具有强烈的免疫抑制作用。临床前模型表明，HLA
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G在癌细胞上的表达使其更具转移性，并显著降低患者的生存率(Lin A等人,Int J Cancer.2012Jul 1；131(1):150
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7.doi:10.1002/ijc.26375；Lin A等人,Hum Immunol.2013Apr；74(4):439
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46.doi:10.1016/j.humimm.2012.11.021)。
[0007]HLA
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G是非经典的I类HLA分子，其首先在绒毛膜癌细胞中被鉴定。与经典的I类HLA分子不同，HLA
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G的特征在于有限的多态性，并且其表达、结构和功能也有所不同。HLAG的初级转录物是可变剪接的，导致七种同种型的表达，其中四种是膜结合的(HLA
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G1，HLA
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G2，HLA
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G3和HLA
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G4)，而其他三种是可溶的(HLA
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G5，HLA
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G6和HLA
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G7)。HLA
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G1和HLA
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G5是研究最多的同种型，并且它们呈现经典I类HLA分子的典型结构：由非共价结合至β2
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微球蛋白(β2M)的三个球形结构域和肽构成的重链，而其他同种型较短，缺乏重链的一个或两个结构域，并且不应与β2M结合。
[0008]考虑到开发CAR免疫疗法的基本标准是适当的TAA的鉴定、转基因效应细胞的可及性和免疫抑制性肿瘤微环境的可逆性，并且还考虑到肿瘤细胞的HLA
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G的新表达及其对肿瘤微环境的免疫抑制作用的贡献和其作为ICP和在免疫逃逸机制中的作用，因此HLA
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G是开发能够阻断该分子的新免疫疗法的杰出候选者。此外，鉴于尚未报道针对同种异体HLA
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G的刺激功能或细胞反应，并且HLA
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G表达是组织受限的，针对HLA
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G的溶细胞性CAR细胞的产生将在癌症免疫治疗领域中开辟新的可能性。
[0009]WO2016/160622公开了针对HLA
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G的抗体及其在CAR细胞中的用途。然而，由于HLA
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G mRNA被剪接成不同的蛋白质同种型，因此需要开发能够特异性识别不同HLA
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G同种型(与β2M缔合的HLA同种型和较小的无β2M的同种型)和/或最丰富的同种型的CAR，以消除表达免疫抑制同种型的大多数细胞，以及开发包含优化间隔结构域和选择标记物的CAR构建体，以改善CAR细胞扩增和选择。

技术实现思路

[0010]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗HLA
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G抗体的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中所述CAR特异性结合1至6种HLA
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G同种型，优选2至5种HLA
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G同种型。2.权利要求1所述的CAR，其中所述CAR特异性结合无β2M的HLA
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G或特异性结合与β2M缔合的HLA
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G同种型。3.权利要求1至2中任一项所述的CAR，其中所述CAR不结合HLA
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G的α1结构域。4.权利要求1至3中任一项所述的CAR，其中所述CAR特异性结合选自HLA
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G1、HLA
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G2、HLA
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G5和HLA
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G6的HLA
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G同种型；或其中所述CAR特异性结合HLA
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G1和HLA
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G5，或特异性结合HLA
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G2和HLA
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G6，和/或特异性结合HLA
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G1/无β2M和HLA
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G5/无β2M同种型。5.权利要求1至4中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域是特异性结合与β2M缔合的HLA
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G的scFv；优选是特异性结合HLA
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G1和HLA
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G5的scFv，并且所述scFv包含：(a)(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1显示大于80％，优选大于90％，还优选大于95％的同一性的同源序列；和(ii)轻链可变区，其包含SEQ ID NO：2或与SEQ ID NO：2显示大于80％，优选大于90％，还优选大于95％的同一性的同源序列；或者(b)(i)包含SEQ ID NO：1的重链可变区的CDR(互补决定区)1、CDR2和CDR3；和包含SEQ ID NO：2的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；或其中所述抗原结合结构域是scFv，其特异性结合无β2M的HLA
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G，优选特异性结合HLA
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G2和HLA
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G6和/或特异性结合HLA
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G1/无β2M和HLA
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G5/无β2M同种型，并且所述scFv包含：(c)(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO：3或与SEQ ID NO：3显示大于80％，优选大于90％，还优选大于95％的同一性的同源序列；和(ii)轻链可变区，其包含SEQ ID NO：4或与SEQ ID NO：4显示大于80％，优选大于90％，还优选大于95％的同一性的同源序列；或者(d)(i)包含SEQ ID NO：3的重链可变区的CDR(互补决定区)1、CDR2和CDR3；和包含SEQ ID NO：4的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。6.权利要求1至5中任一项所述的CAR，其中所述抗HLA
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G抗体是抗HLA
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G scFv，其包含：(a)(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1显示大于80％，优选大于90％，还优选大于95％的同一性的同源序列；和(ii)轻链可变区，其包含SEQ ID NO：2或与SEQ ID NO：2显示大于80％，优选大于90％，还优选大于95％的同一性的同源序列；或者(b)(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO：3或与SEQ ID NO：3显示大于80％，优选大于90％，还优选大于95％的同一性的同源序列；和(ii)轻链可变区，其包含SEQ ID NO：4或与SEQ ID NO：4显示大于80％，优选大于90％，还优选大于95％的同一性的同源序列。7.权利要求1至6中任一项所述的CAR，其中细胞内结构域包含CD3ζ信号传导结构域和任选地选自CD28、41BB、CD28、CD134、ICOS、OX40、CD149、DAP10、CD30、IL2
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R、IL7r6、IL21
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R、NKp30、NKp44、CD27、CD137和DNAM
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1共刺激结构域的至少一个共刺激结构域，优选两个共刺激结构域是41BB和CD28共刺激结构域。8.权利要求1至7中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域选自CD28、CD3和CD8跨膜结构域，优选地，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域。9.权利要求1至8中任一项所述的CAR，其中所述CAR从N至C端顺序地包含：信号肽序列，抗HLA
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G抗体或其抗原结合片段，间隔结构域，跨膜结构域，细胞内结构域，可裂解的接头和截短的人CD19结构域。
10.权利要求9所述的CAR，其进一步包含将所述抗原结合结构域连接至所述跨膜结构域的铰链区，其优选选自(i)人IgG4铰链结构域，(ii)人IgG4铰链结构域和CH3人IgG4结构域，(iii)突变的CH2人IgG4结构域、人IgG4铰链结构域和CH3人IgG4铰链结构域，(iv)CD28铰链和(v)CD8a铰链结构域。11.权利要求10所述的CAR，其中所述铰链结构域包含以下序列或由其组成：...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：因维克蒂斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：