一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的金黄色葡萄球菌电化学检测方法技术

一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的金黄色葡萄球菌电化学检测方法，属于生命科学分析技术领域。其检测原理为：将修饰N3基团的双链DNA固定在金电极表面，在金黄色葡萄球菌存在时，Cu

【技术实现步骤摘要】
一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的金黄色葡萄球菌电化学检测方法


[0001]一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的金黄色葡萄球菌电化学检测方法，属于生命科学分析


技术介绍

[0002]金黄色葡萄球菌属于葡萄球菌属，是人类和动物的一种重要病原菌，能够引起许多严重感染。典型的金黄色葡萄球菌为球形，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。其营养要求不高，在普通培养基上即可生长良好，最适生长温度37℃，最适生长pH 7.4，具有较高的耐盐性，是一种不利于人体和动物的细菌。由于金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因此，食品受其污染的机会很多。美国疾控中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素感染是个世界性卫生问题，在我国，每年因金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件屡有报道。目前，国标中对金黄色葡萄球菌的检测方法包括微生物法和ELISA法。微生物法耗时长，操作繁琐。ELISA方法所耗时间相对较短，但其操作技巧性强，关键点的控制对结果影响大，检出限高达106CFU/mL。聚合酶链式反应为国标法之外研究最成熟的金黄色葡萄球菌检测方法之一，但是该法所需的试剂昂贵，整个检测过程步骤复杂。因而进一步研究一种灵敏度高、易于操作、选择性高的新方法显得尤为重要。
[0003]与此同时，为了提高检测性能，各种信号放大技术，如杂交链式反应、滚环扩增反应、纳米材料、聚合反应等被应用于生物传感领域。其中，原子转移自由基聚合反应(ATRP)具有反应进程可控、反应单体广泛等优点，自90年代被提出以来在材料、合成等领域得到了大量应用，其在生物传感中的应用也得到科研工作者的青睐。

技术实现思路

[0004]针对现存技术不足，本专利技术目的是提供一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的金黄色葡萄球菌电化学检测方法，具有高特异性、高灵敏度等特点。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案：
[0006]一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的金黄色葡萄球菌电化学检测方法，包括以下步骤：
[0007](1)dsDNA的合成
[0008]将2μM ssDNAA和2μM ssDNA B在95℃加热10min，然后缓慢冷却至室温；
[0009](2)金黄色葡萄球菌的培养
[0010]金黄色葡萄球菌在LB培养基中生长过夜，通过离心在指数生长期收获，弃去上清，然后将细菌颗粒重悬于PBS中，通过测量600nm处的光密度(OD)，可以对细菌浓度进行监测。在进行细菌比色检测实验前，将菌种原液的OD
600
值调整为0.1；
[0011](3)金电极的预处理
[0012]用800目、1000目、2000目及5000目砂纸打磨金电极各3
‑
5min；然后用0.3μm和0.05μm的氧化铝悬浮液分别抛光裸露的金电极，再依次用99.99％的乙醇和超净水进行超声清洗；再将所处理过的金电极浸泡在新制备的溶液30％的H2O2和98％的H2SO4＝1∶3 V∶V中10min；之后将电极放在0.5M H2SO4中用循环伏安法在
‑
0.2
‑
1.5V的电位范围内以0.1Vs
‑1的扫速进行电化学处理，直至获得稳定的循环伏安图；最后用超净水冲洗电极表面，并用氮气吹干；
[0013](4)金电极的修饰
[0014]将10μL 1μM于上述(2)中形成的dsDNA滴加到干净的金电极上并在37℃下孵育1.5h；然后金电极用TE缓冲溶液冲洗两次；随后将金电极浸泡在2mM溶解于70％酒精的MCH溶液0.5h；再用TE缓冲液冲洗电极；
[0015](5)点击反应
[0016]将修饰后的金电极浸泡在含50μL 4mM PBIB、5μL 2mM CuSO4和1mL OD
600
＝0.1金黄色葡萄球菌菌液的点击反应溶液中并在37℃下避光孵育40min；
[0017](6)eATRP反应
[0018]将进行上述(5)后所得的金电极用TE溶液冲洗十秒；随后放入含有50μL 10mM FMMA、50μL 10mM Cu
2+
/Me6TREN、500μL 1M KBr、900μL DMF和3500μL 0.1mM KPF6的溶液中，并在其表面施加一个恒定的负电位
‑
0.53V反应40min；再用线性伏安扫描法LSV扫描以去除沉积在电极表面的铜，其设置为：初始电位0V；最终电位0.2V；扫描速率1.0Vs
‑1；最后用DMF和超纯水清洗电极；
[0019](7)电化学测定
[0020]将进行上述(6)后所得的金电极放入1.0M LiClO4溶液中并用方波伏安法SWV对电极表面从头合成的电活性聚合物进行检测，其设置为：初始电位0V，终止电位0.6V，电位增量4.0mV，脉冲幅值25mV，频率15Hz。
[0021]本方法设计并基于细菌介导CuAAC和eATRP原理对金黄色葡萄球菌进行检测，避免了目前常用信号策略中纳米材料和生物酶(易受外界环境如pH和温度影响)的使用，信号得到成倍的放大，灵敏度极大提高的同时，稳定性和重现性相对更高。建立了一种简单、灵敏的检测金黄色葡萄球菌的方法，为今后的监管提供了方便。
附图说明
[0022]图1为检测体系的构建原理示意图。
[0023]图2为检测体系可行性验证方波伏安图。
[0024]图3为不同浓度金黄色葡萄球菌的检测结果图：(A)不同浓度的金黄色葡萄球菌检测的方波伏安图(B)金黄色葡萄球菌与对应电流强度的线性关系图。
具体实施方式
[0025]实施例1.可行性验证
[0026]首先在电极表面构建检测体系，如图1所示。紧接着进行检测体系的可行性验证，实验步骤同
技术实现思路
(1)
‑
(7)。如图2所示，不加金黄色葡萄球菌时，修饰电极(曲线b)电流
强度较弱；相反，加入金黄色葡萄球菌后，修饰电极(曲线a)可以在0.35V附近观察到明显的电流峰值，这是因为体系中大量的Cu
2+
被金黄色葡萄球菌中的铜还原酶NDH
‑
2还原为Cu
+
，然后催化发生CuAAC，之后FMMA通过eATRP被引入到金电极上，产生了极大的电流信号。通过对比实验，充分证明了基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的金黄色葡萄球菌电化学检测方法的可行性。
[0027]实施例2.灵敏度实验
[0028]实验步骤同
技术实现思路
(1)
‑
(7)，分别检测目标液中不同浓度的金黄色葡萄球菌(103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、)产生的电流强本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的金黄色葡萄球菌电化学检测方法，其检测原理为：将修饰N3基团的双链DNA dsDNA固定在金电极表面，在金黄色葡萄球菌存在时，Cu
2+
被细菌中的铜还原酶NDH
‑
2还原为Cu
+
，并催化N3基团与溴代异丁酸丙炔酯PBIB发生叠氮炔环加成反应，随后大量FMMA通过eATRP连接聚合在双链DNA末端，最终经方波伏安法SWV测定电流强度与金黄色葡萄球菌浓度呈正相关，绘制电化学信号与金黄色葡萄球菌浓度之间的标准曲线得到线性方程，测量待测样品的电化学信号通过计算即可实现金黄色葡萄球菌的灵敏检测。2.根据权利要求1所述的一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的金黄色葡萄球菌电化学检测方法，其中dsDNA合成的步骤如下：将2μM ssDNA A和2μM ssDNA B在95℃加热10min，然后缓慢冷却至室温。3.根据权利要求1所述的一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的金黄色葡萄球菌电化学检测方法，其中金黄色葡萄球菌培养的步骤如下：金黄色葡萄球菌在LB培养基中生长过夜，通过离心在指数生长期收获，弃去上清，然后将细菌颗粒重悬于PBS中，通过测量600nm处的光密度OD，可以对细菌浓度进行监测。在进行细菌比色检测实验前，将菌种原液的OD
600
值调整为0.1。4.根据权利要求1所述的一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的金黄色葡萄球菌电化学检测方法，其中金电极预处理的步骤如下：用800目、1000目、2000目及5000目砂纸打磨金电极各3
‑
5min；然后用0.3μm和0.05μm的氧化铝悬浮液分别抛光裸露的金电极，再依次用99.99％的乙醇和超净水进行超声清洗；再将所处理过的金电极浸泡在新制备的水虎鱼溶液中10min；之后将电极放在0.5M H2SO4中用循环伏安法在
‑
0.2
‑
1.5V的电位范围内以0.1Vs...

【专利技术属性】
技术研发人员：许媛媛，苗晋锋，李意，黎伟中，鲍芳，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：