一种抗c-Met单臂抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抗c-Met单臂抗体及其制备方法和应用，属于免疫工程技术领域。本发明专利技术公开的一种抗c-Met单臂抗体由3条链组成：轻链由亲本抗体的轻链可变区1H9D6-V

【技术实现步骤摘要】
一种抗c-Met单臂抗体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及免疫工程
，更具体的说是涉及一种抗c-Met单臂抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)及其受体人间质上皮转化因子(c-mesenchymal epithelial transition factor，c-Met)在肿瘤发生发展中具有重要作用。在实体瘤中，缺氧可以造成HGF和c-Met的高表达，这有利于肿瘤血管生成，并刺激癌细胞的生长、运动和侵袭。在肝癌细胞中，c-Met的蛋白水平比正常肝细胞高25％-100％，这表明c-Met是治疗肝癌的一个潜在靶点。阻断HGF/c-Met信号转导已成为抗肿瘤药物研究的一个重要策略。c-Met抑制剂，如tivantinib、golvatinib和cabozantinib均通过阻断c-Met信号激活。但此类药物的副作用以及肝癌细胞对此类药物的耐药性还有待解决。阻断HGF/c-Met信号转导的抗体药物研发是研究热点，传统二价单克隆抗体与c-Met结合后可引起后者二聚化进而激活肿瘤细胞信号转导通路。
[0003]因此，提供一种抗c-Met单臂抗体及其制备方法和应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术提供了一种抗c-Met单臂抗体及其制备方法和应用，抗c-Met单臂抗体可与c-Met胞外区蛋白结合，同时不会引起c-Met二聚化。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种抗c-Met单臂抗体，由3条链组成：1条轻链，1条重链和1条Fc-knob-His链；所述轻链由亲本抗体的轻链可变区1H9D6-V
L
与人Kappa轻链恒定区HomoCκ拼接获得；所述重链由亲本抗体的重链可变区1H9D6-V
H
与人IgG1-hole-Flag序列拼接获得，其中人IgG1重链恒定区发生3个氨基酸突变，形成臼状结构；所述Fc-knob-His链中人IgG1重链恒定区发生1个氨基酸突变，形成杵状结构。
[0007]进一步，人IgG1重链恒定区发生的3个氨基酸突变为：T366S:L368A:Y407V；人IgG1重链恒定区发生的1个氨基酸突变为T366Y。
[0008]进一步，一种抗c-Met单臂抗体的制备方法，具体步骤如下：
[0009](1)构建抗c-Met单臂抗体轻链慢病毒表达载体pCMV-2E6-L：PCR扩增亲本抗体1H9D6的轻链可变区V
L
基因1H9D6-V
L
，全基因合成人Kappa轻链恒定区HomoCκ，将HomoCκ与1H9D6-V
L
通过同源重组法拼接到慢病毒表达载体pRRL-CMV中，转化，获得pCMV-2E6-L；
[0010](2)构建抗c-Met单臂抗体重链慢病毒表达载体pCMV-2E6-H：PCR扩增亲本抗体1H9D6的重链可变区V
H
基因1H9D6-V
H
，全基因合成IgG1-hole-Flag序列，将1H9D6-V
H
与IgG1-hole-Flag序列通过同源重组法拼接到慢病毒表达载体pRRL-CMV中，转化，获得pCMV-2E6-H；
[0011](3)构建慢病毒表达载体pCMV-Fc-knob-His：通过全基因合成Fc-knob-His，将其与慢病毒表达载体pRRL-CMV连接、转化，获得pCMV-Fc-knob-His；
[0012](4)将pCMV-2E6-L、pCMV-2E6-H和pCMV-Fc-knob-His共转染真核细胞，表达产物通过镍柱纯化、ELISA筛选，获得抗c-Met单臂抗体。
[0013]进一步，所述的抗c-Met单臂抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0014]进一步，所述肿瘤为肝癌或胶质瘤。
[0015]进一步，所述的抗c-Met单臂抗体在抑制HGF/c-Met信号通路中的应用。
[0016]进一步，所述应用为抑制HGF和c-Met结合。
[0017]进一步，所述应用为抑制c-Met磷酸化。
[0018]进一步，所述应用为抑制Gab-1，ERK1/2，Akt及PKB活性。
[0019]进一步，所述的抗c-Met单臂抗体在抑制血管生成或抑制细胞迁移中的应用。
[0020]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种抗c-Met单臂抗体及其制备方法和应用，本专利技术构建的抗c-Met单臂抗体解决了c-met二聚化的问题；抗c-Met单臂抗体能够阻断HGF与c-Met结合，并抑制肝癌细胞系HepG2细胞中HGF/c-Met下游的信号转导，包括：抑制c-Met磷酸化，Gab-1，ERK1/2，Akt及PKB活性；并抑制HepG2细胞增殖与HGF介导的细胞迁移。同时，c-Met单臂抗体可抑制人血管内皮细胞HUVEC的细胞增殖和微管形成。裸鼠肝癌细胞HepG2移植瘤模型研究表明，单臂抗体抑制肿瘤生长，具有较好的抗肿瘤效果。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0022]图1附图为本专利技术抗c-Met单臂抗体的结构示意图；
[0023]其中，V
H
：重链可变区；C
H1
：重链恒定区1；V
L
：轻链可变区；C
L
：轻链恒定区；Knobs：“杵”结构；holes：“臼”结构；
[0024]图2附图为本专利技术亲本抗体1H9D6和抗c-Met单臂抗体2E6的变性和非变性SDS-PAGE电泳结果；
[0025]其中，左图为变性电泳，右图为非变性电泳；M：蛋白Marker，1：1H9D6，2：2E6；
[0026]图3附图为本专利技术1H9D6(三角)、2E6(正方形)和人IgG对照抗体(菱形)与c-Met胞外区融合蛋白结合ELISA结果；每个条件做3个复孔，结果以平均值
±
标准差的形式展示；
[0027]图4附图为本专利技术1H9D6(点划线)、2E6(虚线)和对照组(实线)与HepG2细胞(人肝癌细胞)结合结果；
[0028]图5附图为本专利技术CHO细胞、Hela细胞和HepG2细胞的细胞裂解液与抗c-Met单臂抗体2E6的蛋白免疫印迹结果；
[0029]图6附图为本专利技术不同浓度的1H9D6(黑色圆形)、2E6(黑色方形)和人IgG对照抗体(黑色菱形)与c-Met胞外区融合蛋白预孵育后，对1nM人HGF(人肝细胞生长因子)与c-Met胞外区融合蛋白结合的影响；每个条件做3个复孔，结果以平本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗c-Met单臂抗体，其特征在于，由3条链组成：1条轻链，1条重链和1条Fc-knob-His链；所述轻链由亲本抗体的轻链可变区1H9D6-V
L
与人Kappa轻链恒定区HomoCκ拼接获得；所述重链由亲本抗体的重链可变区1H9D6-V
H
与人IgG1-hole-Flag序列拼接获得，其中人IgG1重链恒定区发生3个氨基酸突变，形成臼状结构；所述Fc-knob-His链中人IgG1重链恒定区发生1个氨基酸突变，形成杵状结构。2.根据权利要求1所述的一种抗c-Met单臂抗体，其特征在于，人IgG1重链恒定区发生的3个氨基酸突变为：T366S:L368A:Y407V；人IgG1重链恒定区发生的1个氨基酸突变为T366Y。3.根据权利要求1所述的一种抗c-Met单臂抗体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)构建抗c-Met单臂抗体轻链慢病毒表达载体pCMV-2E6-L：PCR扩增亲本抗体1H9D6的轻链可变区V
L
基因1H9D6-V
L
，全基因合成人Kappa轻链恒定区HomoCκ，将HomoCκ与1H9D6-V
L
通过同源重组法拼接到慢病毒表达载体pRRL-CMV中，转化，获得pCMV-2E6-L；(2)构建抗c-Met单臂抗体重链慢病毒表达载体pCMV-2E6-H：PCR扩增亲本抗体1H9D6的重链可变区V
H
基因1H9D6-V
H
，全基因合成I...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋明，房健民，尹衍新，郭佳，
申请(专利权)人：同济大学苏州研究院，
类型：发明
国别省市：