本发明专利技术涉及一种细菌菌株，其含有至少一种编码重组蛋白质的基因，其特征在于其含有由以下组成的开放阅读框：(i)编码介导所述蛋白质向周质的易位的N‑末端信号肽的DNA片段，其连接至(ii)编码脂蛋白(Lpp(N))的后续DNA序列(lpp(N))，其与野生型lpp基因编码的脂蛋白Lpp相比，具有至多十个氨基酸的差异，以及(iii)编码脂蛋白(Lpp(C))的另一DNA序列(lpp(C))，其与野生型lpp基因编码的脂蛋白(Lpp)相比，具有至多十个氨基酸的差异。本发明专利技术还涉及一种用于使用根据本发明专利技术的细菌菌株发酵生产重组蛋白质的方法。如此，可能实现与现有技术相比培养基中的重组蛋白的增加的量。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型细菌lpp突变体及其在重组蛋白质的分泌生产中的用途本专利技术涉及一种新型细菌lpp突变体及其在分泌生产重组蛋白质的发酵方法中的用途。近年来，重组蛋白质药物(药物蛋白质/生物制品)的市场增长强劲。特别重要的蛋白质药物为真核生物蛋白质，特别是哺乳动物蛋白质和人蛋白质。重要的药物蛋白质(药物活性蛋白质)的实例为细胞因子、生长因子、蛋白质激酶、蛋白质和肽激素以及抗体和抗体片段。由于药物蛋白质的生产成本仍然很高，因此一直在寻求更有效并因此更具成本效益的方法和其生产系统。通常，重组蛋白质在哺乳动物细胞培养物或在微生物体系中产生。与哺乳动物细胞培养物相比，微生物体系的优势在于，以这种方式可在更短的时间内以更低的成本生产重组蛋白质。因此，细菌特别适合于重组蛋白质的生产。由于其广泛研究的遗传学和生理学、较短的传代时间和简单的操作，革兰氏阴性细菌肠杆菌(Escherichiacoli)目前是生产重组蛋白质最常用的生物。特别有吸引力的是这样的生产方法，其中靶蛋白质被细菌细胞以正确折叠直接释放到发酵培养基中，因为这免去了复杂的细胞破裂和可能的无益的蛋白质重折叠过程。细胞外生产的另一优势为，由于靶蛋白质的积累不受周质或细胞质空间的限制，将靶蛋白质释放到培养基中通常可以提高产物产量。适用于细胞外生产靶蛋白质的是，例如，所谓的大肠杆菌的“渗漏(leaky)”菌株，由于细胞包膜的某些结构元件的缺失或改变，其将位于周质中的蛋白质排放到培养基中的程度增加。这种“渗漏”菌株的外膜中脂蛋白的比例可能改变，尤其是某些Braun的质脂蛋白(lpp)的突变体中(Inouye等，1977,J.Bact.132,308-313页；Suzuki1978,Mol.Gen.Genet.167,1-9页；Giam等，1984,Eur.J.Biochem.141,331-379页)。已经公开了异源蛋白质的工业规模生产方法，其中使用大肠杆菌的不同lpp突变体来实现将靶蛋白质释放到发酵培养基中(US2008/0254511A1，US5,223,482A)。但是，由于细胞裂解的趋势较高，“渗漏”菌株在某些异源靶蛋白质的生产中具有以下缺点：尽管采取了某些稳定细胞的措施例如，向培养基中添加增加量的Ca和Mg离子(见US2008/0254511A1)，它们仍相对较早且强烈地发生裂解，结果是，首先，缩短了蛋白质的生产阶段并因此产物收率低于其在较长的生产阶段的情况中的可能收率。以及其次，细胞裂解导致培养基粘度升高，这尤其可归因于细胞裂解时释放的DNA。结果，靶蛋白质的后续纯化和回收变得更困难，且这又导致不必要的高处理成本。本专利技术的目的为提供一种用于生产重组靶蛋白质的发酵方法中使用的突变的细菌菌株，其中靶蛋白质的主要部分在培养过程中被分泌到发酵培养基中，并且存在于培养基中的靶蛋白质的量高于现有技术中公开的细菌菌株的情况，即，靶蛋白质将以增加的产量存在于培养基中。该目的通过含有至少一种编码重组蛋白质的基因的细菌菌株实现，其特征在于：所述细菌菌株含有由以下组成的开放阅读框：I编码介导所述蛋白质向周质的易位的N-末端信号肽的DNA片段，其连接至ii编码脂蛋白(Lpp(N))的后续DNA序列(lpp(N))，其与野生型lpp基因编码的脂蛋白Lpp相比，具有至多十个氨基酸的差异，以及iii编码脂蛋白(Lpp(C))的另一DNA序列(lpp(C))，其与野生型lpp基因编码的脂蛋白(Lpp)相比，具有至多十个氨基酸的差异。该细菌菌株优选特征在于其为革兰氏阴性细菌，特别优选来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)家族的细菌菌株，特别优选大肠杆菌种的菌株。开放阅读框(ORF)是指DNA或RNA的位于起始密码子和终止密码子之间并编码蛋白质的氨基酸序列的区域。ORF也称为编码区域。ORF被非编码区域包围。因此，基因是指含有用于产生生物活性RNA的所有基本信息的DNA片段。因此，基因不仅含有通过转录产生单链RNA拷贝的DNA片段，而且还含有参与该拷贝过程的调控的其他DNA片段。由于基因含有至少一个ORF，因此基因也编码至少一种蛋白质。在ORF中，DNA的碱基三联体(triplet)在每种情况下编码特定的氨基酸或终止信号。被编码为用于形成蛋白质的构件的氨基酸也称为蛋白质原氨基酸。在本专利技术的上下文中以单数使用的术语“一种/该重组蛋白质”还可以意指多种不同的重组蛋白质。优选考虑1至3种不同的重组蛋白质，特别优选1种重组蛋白质或2种不同的重组蛋白质。该重组蛋白质也称为靶蛋白质。大肠杆菌Lpp野生型基因的DNA序列(SEQIDNo.1，以EcoGeneaccessionNo.EG10544公开)编码未加工的Lpp蛋白质(Lpp前蛋白质)，其由78个氨基酸组成(SEQIDNo.2)。在此，前60个核苷酸编码信号肽，该信号肽控制蛋白质分泌到周质中，并在易位(加工)后被切割掉。分别位于加工的Lpp野生型蛋白质的N-末端和C-末端的为半胱氨酸残基(Cys)和赖氨酸残基(Lys)(参见图1B)，其均被细胞翻译后修饰，从而确保Lpp蛋白质的完整功能，即外膜与肽聚糖层(也称为细菌细胞壁)的连接(Giam等，1984,J.Biol.Chem.259,5601-5605页)。术语Lpp、Lpp蛋白质、野生型Lpp蛋白质和Lpp野生型蛋白质在本专利技术中同义使用，并且在技术文献中也称为脂蛋白、胞壁脂蛋白(mureinlipoprotein)或Braun的质脂蛋白。蛋白质Lpp由基因lpp(lpp基因、野生型lpp基因、Lpp野生型基因)编码。根据本专利技术的细菌菌株含有ORF，该ORF由编码N-末端信号肽的DNA片段、lpp(N)和lpp(C)组成。所述ORF编码的蛋白质为Lpp融合蛋白质。在本专利技术的上下文中，Lpp融合蛋白质应理解为是指由两个Lpp蛋白质(下文称为Lpp部分，每个部分对应于可能突变的Lpp野生型蛋白质)组成并以未加工的形式携带信号肽(SP)的融合蛋白质。图1A示意性地表示未加工形式的这种融合蛋白质。在这种情况下，与未加工形式的融合蛋白质的信号肽连接的N-末端部分(Lpp(N))与C-末端部分(Lpp(C))连接。Lpp(N)和Lpp(C)可以直接连接或通过由一个至多于一个氨基酸组成的氨基酸接头序列(L)连接。融合蛋白质的两个Lpp部分的每一个的氨基酸序列在每种情况下可以对应于加工的Lpp野生型序列，或者与加工的Lpp野生型序列相比在氨基酸序列中包含至多十个突变，两个Lpp部分的突变不一定是相同的。在本专利技术中，Lpp融合蛋白质也称为2xLpp蛋白质，并由2xlpp基因编码。Lpp融合蛋白质的氨基酸序列中可能存在的突变包括取代(氨基酸置换)、缺失(氨基酸不存在)和插入(其他氨基酸插入)。在根据本专利技术的菌株中，编码Lpp融合蛋白质的2xlpp基因存在于染色体上或质粒上。优选地，编码Lpp融合蛋白质的基因位于染色体上。优选地，该细菌菌株的特征在于其不含有编码与加工的野生型Lpp蛋白质相比具有至少80％同一性的蛋白质的其本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种细菌菌株，其含有至少一种编码重组蛋白质的基因，其特征在于，所述细菌菌株含有开放阅读框，所述开放阅读框由以下组成：/ni编码介导所述蛋白质向周质的易位的N-末端信号肽的DNA片段，其连接至/nii编码脂蛋白(Lpp(N))的后续DNA序列(lpp(N))，所述脂蛋白与野生型lpp基因编码的脂蛋白Lpp相比，具有至多十个氨基酸的差异，以及/niii编码脂蛋白(Lpp(C))的另一DNA序列(lpp(C))，所述脂蛋白与野生型lpp基因编码的脂蛋白(Lpp)相比，具有至多十个氨基酸的差异。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种细菌菌株，其含有至少一种编码重组蛋白质的基因，其特征在于，所述细菌菌株含有开放阅读框，所述开放阅读框由以下组成：
i编码介导所述蛋白质向周质的易位的N-末端信号肽的DNA片段，其连接至
ii编码脂蛋白(Lpp(N))的后续DNA序列(lpp(N))，所述脂蛋白与野生型lpp基因编码的脂蛋白Lpp相比，具有至多十个氨基酸的差异，以及
iii编码脂蛋白(Lpp(C))的另一DNA序列(lpp(C))，所述脂蛋白与野生型lpp基因编码的脂蛋白(Lpp)相比，具有至多十个氨基酸的差异。
2.如权利要求1的细菌菌株，其特征在于，所述细菌菌株为大肠杆菌()种的菌株。
3.如权利要求1或2中任一项或两项的细菌菌株，其特征在于，其不含有其他基因，所述其他基因编码与加工的野生型Lpp蛋白质相比具有至少80％的同一性的蛋白质。
4.如权利要求1至3中一项或多项的细菌菌株，其特征在于，Lpp(N)和Lpp(C)通过由一个至多于一个的氨基酸组成的接头连接。
5.如权利要求1至4中一项或多项的细菌菌株，其特征在于，lpp(N)和lpp(C)编码的氨基酸序列与野生型Lpp蛋白质的氨基酸序列的区别在于：
对于Lpp(N)，存在于野生型Lpp蛋白质中的C-末端氨基酸赖氨酸不存在，或
对于Lpp(C)，存在于野生型Lpp蛋白质中的N-末端氨基酸半胱氨酸不存在。
6.如权利要求1至5中一项或多项的细菌菌株，其特征在于，在由lpp(N)或lpp(C)编码的氨基酸序列中的至少一个中，在氨基酸位置77代替精氨酸而存在的是任何其他蛋白质原氨基酸(基于未加工的野生型Lp...
【专利技术属性】
技术研发人员：T·达斯勒，M·库尧，
申请(专利权)人：瓦克化学股份公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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