测序用核苷酸的制备方法技术

一种制备式(I)所示化合物的方法，其特征在于，/n(1)将式(II)所示化合物与第一磷酸化试剂进行第一亲核取代反应，所述第一磷酸化试剂为三氯氧磷，其中，所述式(II)所示化合物预先与质子海绵进行第一混合处理；/n(2)将第一亲核取代反应产物与第二磷酸化试剂进行第二亲核取代反应，以便获得式(I)所示化合物，所述第二磷酸化试剂不同于所述第一磷酸化试剂；/n

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】测序用核苷酸的制备方法优先权信息无
本专利技术涉及化学领域，具体地，本专利技术涉及测序用核苷酸的制备方法。
技术介绍
DNA测序(DNAsequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是要测定腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)四个碱基的排列方式。随着人类基因组计划的开展，相关测序技术也得到了迅速发展。当前，测序技术已经成为现代生物学研究中重要的手段之一。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医药科学等具有非常重要的意义。目前，全基因组DNA测序技术已经成为国际上一个竞争十分激烈的研究领域。在1975年，Sanger等人开创了第一代DNA测序技术，并在1977年完成了第一个基因组序列(噬菌体X174)的测序工作。但因其测序成本高，通量小等问题，使得denovo测序、转录组测序等应用难以普及，这也促进了人类对新型测序方法的探索。经过技术的不断积累，以Roche、illumina、ABI等公司推出了第二代测序方法。较之第一代方法，虽然第二代方法在测序准确度和读长上稍有让步，但因其实现了高通量，使得测序技术在疾病的诊断与治疗，物种生物学研究等领域有了广泛的应用。在有了二代测序技术的理论支持后，现阶段面临的问题之一便是如何提高测序的准确度与精确。测序用试剂，也即测序用核苷酸的纯度对测序结果准确度与精确度会有直接影响，因此现阶段亟需开发一种新型的高纯度的，且能够批量生产的测序用核苷酸。
技术实现思路
现有技术中的3’-羟基保护的核苷酸(dNTP)的工业化生产中，三磷酸化反应的产率低，杂质多，且反应产生的二磷酸与四磷酸杂质与产品性质相似，难以提纯分离。因此导致整体生产收率低，产品纯度也较低，从而影响测序结果的准确度与精确度。为了解决上述问题，本申请提出了一种全新的氰基乙烯核苷酸的制备方法，该方法具有总产率高，反应条件简单，操作方便，产品便于纯化，重现性好，便于工业化大生产等优点，利用该方法可以批量、稳定的制备高纯的3’-氰基乙烯氧基核苷酸。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种制备式(I)所示化合物的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：(1)将式(II)所示化合物与第一磷酸化试剂进行第一亲核取代反应，所述第一磷酸化试剂为三氯氧磷，其中，所述式(II)所示化合物预先与质子海绵(protonsponge)进行第一混合处理；(2)将第一亲核取代反应产物与第二磷酸化试剂进行第二亲核取代反应，以便获得式(I)所示化合物，所述第二磷酸化试剂不同于所述第一磷酸化试剂；其中，R1为H或OH，Base为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，R2为H或荧光标记物。三氯氧磷与式(II)所示化合物进行第一亲核取代生成活性磷酸酯中间体，之后该活性磷酸酯中间体会与第二磷酸化试剂反应得到式(I)所示化合物。其中，三氯氧磷本身为磷酸化试剂，其活性大，但其容易生成很多副产物，如会直接取代羟基生成卤化物，而不会得到活性磷酸酯，专利技术人在反应中，开创性地引入了质子海绵做缚酸剂，质子海绵相较于其他有机及无机碱，碱性强且没有亲和性，且自身位阻较大，不会和反应原料及试剂发生副反应。在反应中结合质子后生产的产物与三磷酸化后的产品在DEAE柱上色谱行为相差大，不影响产物的进一步分离提纯，使得整个生产工艺成本更可控，重现性及操作性更好。由此，根据本专利技术实施例的方法具有总产率高，反应条件简单，操作方便，产品便于纯化，重现性好，便于工业化大生产等优点，利用该方法可以批量、稳定的制备高纯的3’-氰基乙烯氧基核苷酸及其衍生物。附图说明图1为根据本专利技术实施例的3’-氰基乙烯氧基腺嘌呤核苷酸制备提纯后分析HPLC图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。示例中的试剂、检测仪器等，如无特殊说明，可自配或者通过市售途径获取。本专利技术中“室温”指的是温度由大约10℃到大约40℃。在一些实施例中，“室温”指的是温度由大约20℃到大约30℃；在另外一些实施例中，“室温”指的是20℃，22.5℃，25℃，27.5℃等等。在本专利技术的上下文中，所有在此公开了的数字均为近似值。每一个数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％或10％差异。每当公开一个具有N值的数字时，任何具有N+/-1％，N+/-2％，N+/-3％，N+/-5％，N+/-7％，N+/-8％或N+/-10％值以内的数字会被明确地公开，其中“+/-”是指加或减。每当公开一个数值范围中的一个下限，DL，和一个上限，DU，时，任何处于该公开了的范围之内的数值会被明确地公开。本专利技术所述的所有反应步骤反应到一定程度如原料消耗大约大于70％，大于80％，大于90％，大于95％，或经检测反应原料已经消耗完毕后进行后处理，如冷却，收集，提取，过滤，分离，净化处理或其组合。可以通过常规的方法如薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)等方法检测反应程度。可以采用常规的方法对反应溶液进行后处理，例如，通过减压蒸发或常规蒸馏反应溶剂后收集粗产物，直接投入下一步反应；或直接过滤得到粗产物，直接投入下一步反应；或静置后，倾倒出上层清液得到粗产物，直接投入下一步反应；或选择适当的有机溶剂或其组合进行萃取，蒸馏，结晶，柱层析，润洗，打浆等纯化步骤。本专利技术所述的各滴加过程以及所述的各步反应均在一定温度条件下进行，任何适合使用于各滴加过程或各反应过程的温度均包含在本专利技术中。另外，本领域的许多类似改动，等同替换，或等同于本专利技术所描述的温度及温度范围，均视为本专利技术的包含范围。本专利技术给出了各滴加过程较佳的温度或温度范围，以及各反应较佳的反应温度。本专利技术所述的各反应步骤所使用的溶剂没有特别限制，任何在一定程度上能溶解起始原料并且不抑制反应的溶剂均包含在本专利技术中。另外，本领域的许多类似改动，等同替换，或等同于本专利技术所描述的溶剂，溶剂组合，及溶剂组合的不同比例，均视为本专利技术的包含范围。本专利技术给出了各反应步骤所使用的较佳的溶剂。制备式(I)所示化合物的方法在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种制备式(I)所示化合物的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：(1)将式(II)所示化合物与第一磷酸化试剂进行第一亲核取代反应，所述第一磷酸化试剂为三氯氧磷，其中，所述式(II)所示化合物预先与质子海绵进行第一混合处理；(2)将第一亲核取代反应产物与第二磷酸化试剂进行第二亲核取代反应，以便获得式(I)所示化合物，所述第二磷酸化试剂不同于所述第一磷酸化试剂；其中，R1为H或OH，Base为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，R2为H或荧光标记物。三氯氧磷与式(II)所示化合物进行第一亲核取代生成活性磷酸酯中间体，之后该活性磷酸酯中间体会与第二磷酸化试剂反应得到式(I)所示化合物。其中，三氯氧磷本身为磷酸化试剂，其活性大，但是三氯氧磷在反应过程中容易本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备式(I)所示化合物的方法，其特征在于，/n(1)将式(II)所示化合物与第一磷酸化试剂进行第一亲核取代反应，所述第一磷酸化试剂为三氯氧磷，其中，所述式(II)所示化合物预先与质子海绵进行第一混合处理；/n(2)将第一亲核取代反应产物与第二磷酸化试剂进行第二亲核取代反应，以便获得式(I)所示化合物，所述第二磷酸化试剂不同于所述第一磷酸化试剂；/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】一种制备式(I)所示化合物的方法，其特征在于，
(1)将式(II)所示化合物与第一磷酸化试剂进行第一亲核取代反应，所述第一磷酸化试剂为三氯氧磷，其中，所述式(II)所示化合物预先与质子海绵进行第一混合处理；
(2)将第一亲核取代反应产物与第二磷酸化试剂进行第二亲核取代反应，以便获得式(I)所示化合物，所述第二磷酸化试剂不同于所述第一磷酸化试剂；



其中，R
1为H或OH，

Base为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，
R
2为H或荧光标记物。



根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一亲核取代反应是在无水无氧的条件下进行的。


根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述式(II)所示化合物与质子海绵的摩尔比为1:2。


根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一混合处理是在PO(OMe)
3溶剂中、在无水无氧的条件下进行的。



根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述式(II)所示化合物与PO(OMe)
3的用量比为1g:20mL。



根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在0℃的条件下，将所述三氯氧磷滴加至预先经过所述第一混合处理的式(II)所示化合物中。


根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述式(II)所示化合物与三氯氧磷的摩尔比为1：(4-6)，优选1:5。


根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一亲核取代反应是在温度为0℃的条件下进行3小时。


根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二亲核取代反应是在无水无氧的条件下进行的。


根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二磷酸化试剂为(Bu
3N)
2PPi。



根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述(Bu
3N)
2PPi预先在乙腈中进行溶解处理，所述溶解处理是在无水无氧条件下进行5-10分钟。



根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述(Bu
3N)
2PPi与乙腈的用量比为3.63g:20mL。



根据权利要求11所述的方法，其特征在于，在所述溶解处理后、第二亲核取代反应前，进一步包括溶解处理后的(Bu
3N)
2PPi与三乙胺进行第二混合处理。



根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述式(II)所示化合物与(Bu
3N)
2PPi的摩尔比为1：(1-3)，优选为1:2.5；

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【专利技术属性】
技术研发人员：汪文锦，张振华，张佳文，蓝温龙，李汉东，章文蔚，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44