本发明专利技术公开了一种基于气相色谱法的大熊猫粪便短链脂肪酸含量在线检测方法，涉及短链脂肪酸检测技术领域，以2‑乙基丁酸为内标物，并配置标准品溶液，先根据标准溶液加入内标液上机检测，配制峰面积和溶液浓度的标准曲线，得出标准曲线方程，然后样品溶液中加入内标液，上机检测得图谱，根据标准曲线方程计算即可得知相应目标物的含量。本发明专利技术提供的检测方法提取安全快捷，检测灵敏性高、重复性好、检测速度快，可批量处理，能进行高效精确定量，具有良好的科研前景及推广意义。
【技术实现步骤摘要】
一种基于气相色谱法的大熊猫粪便短链脂肪酸含量在线检测方法
本专利技术涉及短链脂肪酸检测
，具体涉及的是一种基于气相色谱法的大熊猫粪便短链脂肪酸含量在线检测方法。
技术介绍
短链脂肪酸(ShortChainFattyAcids,简称SCFA)是碳原子数1～6的挥发性有机酸，由肠道菌群代谢产生，主要包括乙酸、丙酸和丁酸。可以为肠上皮细胞提供能量，并且在维持肠道完整性和调节肠道免疫功能中发挥重要作用。在肠炎条件下，SCAFs促进肠道黏膜细胞增殖，保护肠道屏障，抑制促炎因子分泌从而缓解肠道炎症。而不同短链脂肪酸可反映大熊猫肠道菌群类别，对SCAFs进行检测以便于进一步对大熊猫肠道菌群深入研究。常用的SCAFs定量方法包括气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管色谱法等，其中气相色谱法最为常见。气相色谱法样本前处理主要包括盐酸酸化，醋酸乙酯或乙醚提取后进行衍生化分析。盐酸属于危化品操作安全性差，乙醚对甲酸、乙酸等小分子有机酸萃取效率较低，也存在安全性差问题，衍生化操作要求高比较耗时且所采用试剂保存麻烦，安全性差。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种基于气相色谱法的大熊猫粪便短链脂肪酸含量在线检测方法，以解决现有技术安全性差、衍生化操作要求高、比较耗时且所采用试剂保存麻烦的技术问题。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种基于气相色谱法的大熊猫粪便短链脂肪酸含量在线检测方法，包括如下步骤：(1)配制乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸共7种短链脂肪酸组成的系列浓度标准品储备液和以2-乙基丁酸为内标物的内标储备液，备用；(2)样品上机前处理；将采集的粪便样品与PBS缓冲液混合，加入内标储备液并振荡均匀，然后离心，收集上清液并重复离心一次，使用磷酸调节样品pH为3.0，装入气相色谱进样瓶，待上机；(3)气相色谱上机检测参数设定；DB-FFAP柱，规格为30m×250μm×0.25μm；以高纯氮气为载气，体积流量1.0mL/min，进样体积0.5μL，不分流，空气流速400mL/min，氢气流速30mL/min，载气流速30mL/min，检测器FID温度280℃，进样口温度250℃，气相色谱升温程序如下：60℃下维持0.5min；以10℃/min速度升温至180℃维持1min；随后以20℃/min速度升温至200℃维持10min；(4)将装入样品的气相色谱进样瓶上机，进行检测；(5)取系列浓度标准品储备液，并加入内标储备液，上机检测，绘制标准曲线，得出标准曲线方程；(6)根据步骤(4)检测数据和步骤(5)绘制的标准曲线方程，即可测算出样品中个短链脂肪酸的含量。作为优选地，步骤(1)中，所述系列浓度标准品储备液的配置过程为：取同质量的7种短链脂肪酸，用20％磷酸稀释，配制成10mg/mL混合标准品母液，随后用20％磷酸稀释为1mg/mL混合标准品储备液，然后使用20％磷酸逐级稀释，配置成混合标准液，4℃冷藏备用。进一步地，步骤(1)中，所述内标储备液的配置过程为：吸取2-乙基丁酸用20％磷酸稀释配制成10mg/mL内标母液，随后稀释为50μg/mL内标储备液，4℃冷藏备用。更进一步地，步骤(2)中，粪便样品与PBS缓冲液以1:2的质量比进行混合，使用的磷酸为20％磷酸。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供的检测方法提取安全快捷，检测灵敏性高、重复性好、检测速度快，可批量处理，能进行高效精确定量，具有良好的科研前景及推广意义。附图说明图1是7种短链脂肪酸标准品及2-乙基丁酸GC图谱，此图为10μg/mL的7种短链脂肪酸(从左到右依次是乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸、正戊酸、正己酸)标准品及2-乙基丁酸GC图谱。图2是大熊猫粪便样品GC图谱，使用10μg/mL2-乙基丁酸进行内标定量计算。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合各实施例和附图对本专利技术作进一步说明，本专利技术的实现方式包括但不仅限于以下实施例。实施例1本实施例提供的大熊猫粪便短链脂肪酸含量在线检测方法，包括如下步骤：1.溶液配制SCFAs混合标准品储备液配制乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸共7种，根据密度吸取一定体积的各标准品，用20％磷酸稀释，配制成10mg/mL混合标准品母液，随后用20％磷酸稀释为1mg/mL混合标准品储备液。然后使用20％磷酸逐级稀释，配置成混合标准液，4℃冷藏备用。内标储备液配制以2-乙基丁酸为内标物，吸取2-乙基丁酸用20％磷酸稀释配制成10mg/mL内标母液。随后稀释为50μg/mL内标储备液。4℃冷藏备用。2.样品上机前处理将采集的粪便样品按照1:2质量比与PBS缓冲液混合，加入适量内标储备液于200rpm/min振荡30min，4000rpm/min离心10min，收集上清液重复离心一次，使用20％磷酸调节样品pH为3.0，并气相色谱进样瓶，待上机。3.气相色谱上机检测参数设定DB-FFAP柱，规格为30m×250μm×0.25μm；以高纯氮气为载气，体积流量1.0mL/min，进样体积0.5μL，不分流，空气流速400mL/min，氢气流速30mL/min，载气流速30mL/min，检测器FID温度280℃，进样口温度250℃，气相色谱升温程序如下：60℃下维持0.5min；以10℃/min速度升温至180℃维持1min；随后以20℃/min速度升温至200℃维持10min。4.绘制标准曲线取系列标准品储备液，加入内标储备液，加入内标储备液后，内标物浓度为10μg/mL，进行上机分析，利用软件以7种SCFAs峰面积与相应的内标峰面积之比为纵坐标，以SCFAs浓度为横坐标绘制曲线，通过绘制所得的曲线即可得到大熊猫生物样本中7种SCFAs的标准曲线及线性相关系数。取信噪比S/N>3作为方法的检测限，S/N>10作为方法的定量限。试验结果表明，被测的7种短链脂肪酸的标准曲线线性良好，拟合系数大于0.99，线性范围：满足定量要求。化合物标准曲线方程拟合系数线性范围(μg/ml)乙酸Y＝0.997502X-0.01392660.9992410-0.1丙酸Y＝1.38345C-0.01189860.9991910-0.1异丁酸Y＝1.27060X-0.00394990.9990710-0.1正丁酸Y＝1.37757X-0.01246410.9993510-0.1异戊酸Y＝0.963814X-0.005554040.9996710-0.1正戊本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于气相色谱法的大熊猫粪便短链脂肪酸含量在线检测方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)配制乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸共7种短链脂肪酸组成的系列浓度标准品储备液和以2-乙基丁酸为内标物的内标储备液，备用；/n(2)样品上机前处理；将采集的粪便样品与PBS缓冲液混合，加入内标储备液并振荡均匀，然后离心，收集上清液并重复离心一次，使用磷酸调节样品pH为3.0，装入气相色谱进样瓶，待上机；/n(3)气相色谱上机检测参数设定；DB-FFAP柱，规格为30m×250μm×0.25μm；以高纯氮气为载气，体积流量1.0mL/min，进样体积0.5μL，不分流，空气流速400mL/min，氢气流速30mL/min，载气流速30mL/min，检测器FID温度280℃，进样口温度250℃，气相色谱升温程序如下：60℃下维持0.5min；以10℃/min速度升温至180℃维持1min；随后以20℃/min速度升温至200℃维持5min；/n(4)将装入样品的气相色谱进样瓶上机，进行检测；/n(5)取系列浓度标准品储备液，并加入内标储备液，上机检测，绘制标准曲线，得出标准曲线方程；/n(6)根据步骤(4)检测数据和步骤(5)绘制的标准曲线方程，即可测算出样品中个短链脂肪酸的含量。/n...
【技术特征摘要】
1.一种基于气相色谱法的大熊猫粪便短链脂肪酸含量在线检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸共7种短链脂肪酸组成的系列浓度标准品储备液和以2-乙基丁酸为内标物的内标储备液，备用；
(2)样品上机前处理；将采集的粪便样品与PBS缓冲液混合，加入内标储备液并振荡均匀，然后离心，收集上清液并重复离心一次，使用磷酸调节样品pH为3.0，装入气相色谱进样瓶，待上机；
(3)气相色谱上机检测参数设定；DB-FFAP柱，规格为30m×250μm×0.25μm；以高纯氮气为载气，体积流量1.0mL/min，进样体积0.5μL，不分流，空气流速400mL/min，氢气流速30mL/min，载气流速30mL/min，检测器FID温度280℃，进样口温度250℃，气相色谱升温程序如下：60℃下维持0.5min；以10℃/min速度升温至180℃维持1min；随后以20℃/min速度升温至200℃维持5min；
(4)将装入样品的气相色谱进样瓶上机...
【专利技术属性】
技术研发人员：张文平，郑丽君，谢军金，侯蓉，王海瑞，张志和，黄河，陈鹏，张亮，沈富军，刘佳文，
申请(专利权)人：成都大熊猫繁育研究基地，
类型：发明
国别省市：四川;51
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