用于检测来自DNA或RNA生物体的样品靶标的可掺入参照标准品制造技术

本发明专利技术涉及用于定性和定量检测如新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)RNA的掺入(Spike‑in)采集样品的阳性参考品。

【技术实现步骤摘要】
用于检测来自DNA或RNA生物体的样品靶标的可掺入参照标准品
本专利技术属于诊断领域。具体地，本专利技术涉及用于定量检测样品中的核酸靶标的重组病毒颗粒及其应用。
技术介绍
冠状病毒感染人体可导致肺炎，如COVID-19等。对冠状病毒的核酸快速检测已成为控制病毒扩散、病人诊断、治疗及预防的重要技术之一。自2019年12月由新型冠状病毒2019-nCoV(2020年2月12日国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为“SARS-CoV-2”)，感染人体产生新型冠状病毒肺炎流行(世界卫生组织将新型冠状病毒感染的肺炎命名为“COVID-19”)，发现2019-nCoV携带者、易感人群、发病率、治病率和死亡率，已成为国内外政府和人们十分关注和敏感的问题。对2019-nCoV的核酸快速检测已成为控制病毒扩散、病人诊断、治疗及预防的重要技术之一。目前，国内外已针对2019-nCoV研发试剂盒。3月6日，国家药品监督管理局共批准新冠病毒核酸检测试剂10个，抗体检测试剂5个(图1)。但由于缺乏可用于2019-nCoV核酸检测试剂盒及相关设备的与2019-nCoV相似的阳性对照品，不能对这些已推出使用的核酸检测试剂盒，及其相关设备获得的检测结果的精确性(阳性和阴性)作出很好的判断，即便出现假阴性，也并不可靠，更不能计算待测样本的单位体积病毒颗粒数量(如500病毒颗粒/ml)。2月12日，美国CDC表示，他们自研的检测试剂盒被证实存在缺陷，随后被紧急撤回。这批测试套件中的一个部件缺陷，导致全美众多公共卫生实验室无法使用。>鉴于此，迫切需要能准确反映检测准确性及定量2019-nCoV的参照标准品去确认假阳性，并从定性提升到定量，以便更好地观察冠状病毒RNA的动态分析，并用于对病人治疗标准的判断。此外，能准确反映检测准确性及定量2019-nCoV的参照标准品也可用于新药实验，通过不同时期的病毒载量(viralload)(Zou，etal.2020，Kim，etal.2020，Pan，etal.2020)来评估药物的作用及其质量。聚合酶链反应(PCR)自20世纪90年代初以来被广泛用作诊断工具。聚合酶链反应的使用通过在各种样品中提供快速、特异和灵敏的微生物核酸检测，彻底改变了微生物的诊断检测。最初，假阳性结果是以前产生的扩增子反应污染的结果，是使用这种新技术的人主要关心的问题。采取措施避免预扩增核酸的污染，并通过引入实时聚合酶链反应实现了实质性的改进。这是因为实时聚合酶链反应是一个封闭的管系统，不需要扩增子的聚合酶链反应后分析；当应用这项技术时，仍然被认为是污染和假阳性结果的主要来源。此外，人们越来越重视将假阴性结果的影响降至最低；即确保阴性结果真正代表聚合酶链反应诊断靶的缺失。这是因为假阴性结果可能由测试步骤之一(核酸提取、反转录反应、聚合酶链反应建立或扩增)的失败而产生。第一种控制假阴性结果的方法是在聚合酶链反应中加入与被检测靶标核酸序列不同的外源核酸，作为反应体系的掺入内标(SpikeinInternalcontrols)通常是质粒DNA，在样品中存在任何PCR扩增抑制物质都会降低或完全抑制核酸的扩增。基于此原理，公开的文献已披露使用质粒的单个和多个内部质控品，用于几种病原体的诊断(etal.2003，Dingleetal.2004，Hymasetal.2005，Maaroufietal.2006)。然而，这种掺入内标方法仅可用于评估扩增步骤引起的假阴性。在检测病毒核酸的情况下，也有必要控制扩增前的各个步骤，例如从血浆中收集病毒颗粒和提取病毒核酸，使用咽拭子采集新冠病毒并保存在一定的储存液，在一定的时限内提取病毒RNA再进行RT-PCR核酸检测。需要使用新的方法克服这种局限性。最初，在核酸提取之前加入外源核酸，用来评估核酸提取的效率，但无法正确评估在样本采集过程中病毒颗粒的丢失。因此，理想的对照品(标准品)应该是能被保护的核酸，需要有在结构上和待检病毒颗粒有相似并存在与RT-PPCR病毒核酸检测的全过程。此外，受保护的DNA或RNA的构建将保护核酸在长期储存后免受核酸酶或水解的降解，如果病毒RNA作为对照品，这一点尤其重要。病毒或假病毒颗粒，含有与待测核酸靶标相同种类的核酸(DNA或RNA)，结构稳定，设计为与待测病原体同时经历相同的步骤，已用于病毒靶标的检测分析(Clelandetal.1999，Garsonetal.2005，Clancyetal.2008)。出于人类和动物的安全性，科学家优先选择了非致病性病毒为基本骨架进行改造，并可掺入待测样本的内标(Dreieretal.2005，Gerrietsetal.2008，Ninoveetal.2011)。在本专利技术前，实时荧光PCR反应分析中使用了两类外源性内标。竞争性掺入内标具有与待测样本靶标相同引物的序列，可以在同一PCR反应中使用和待测靶标相同的引物对，但使用掺入内标和待测靶标的探针序列不同。非竞争性内标碱基百分比组成和序列与待测样本靶标完全不同的检测序列。竞争性内标可以模拟靶序列的扩增动力学；然而，它会在低浓度待测靶标PCR反应体系中与待测靶序列竞争。完全与靶标序列不同的非竞争性掺入内标可以被设计和制备成适合使用于几个待测靶序列；非竞争性质控品的扩增通常不能反映待测靶序列的扩增动力学(Rosenstrausetal.1998，Hoorfaretal.2004，Sharmaetal.2014)。因此，需要根据不同的检测需求选择竞争性和非竞争性内标。已发表的相关文献中，利用牛腹泻病毒(Clelandetal.1999)、犬瘟热病毒(Clancyetal.2008)、鼠巨细胞病毒(Garsonetal.2005)以及T4和MS2噬菌体(Dreieretal.2005，Rolfeetal.2007，Gerrietsetal.2008，Ninoveetal.2011)，制备非竞争性内标并用于包括丙型肝炎病毒(HCV)在内的多种DNA和RNA病毒的检测。以噬菌体λ和Qβ为骨架基础研发的竞争性内标的模拟假病毒已用于多种病毒的检测(etal.2003，&Berg2004，Villanovaetal.2007，Mengetal.2009)；针对待测靶标的竞争性假病毒内标包含病原体特异性靶标核酸序列和由噬菌体λ和病毒的外壳蛋白，例如基于MS2外壳蛋白制备的第一个被称为“装甲RNA”的商业化竞争内标(Pasloskeetal.1998)。还有多种竞争性内标使用的报道(WalkerPeachetal.1999，Drostenetal.2001，Beldetal.2004，Chengetal.2006，Zhaoetal.2007，Weietal.2008，Mengetal.2009，Zhanetal.2009，Felder&2014，Sharmaetal.2014)。Zambenedetti等人报道了以MS2噬菌体为基础，构建了利用大肠杆菌为宿主制备的竞争性内标的模拟病毒，并经测试把各种竞争性内标的假病毒用于丙型肝炎病毒的诊断过程中的监控提取、反转录、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.模拟病毒载体，其特征在于以病毒(优选慢病毒或腺病毒)骨架为载体，在慢病毒骨架中包含一个或多个定量检测核酸片段和用于示踪的荧光蛋白的编码基因，/n所述定量检测核酸片段的长度与检测样品的核酸靶标序列长度相同，且与所述检测样品的核酸靶标序列含有相同百分比的碱基组成，其中定量检测核酸片段的5’端序列A和3’端序列B与检测样品的核酸靶标序列的相应5’端序列A’和3’端序列B’的序列相同或不相同，其中序列A由用于扩增检测样品的核酸靶标序列的5’端引物序列与其临近下游2个碱基组成，序列B由用于扩增检测样品的核酸靶标序列的3’端引物序列与其临近上游2个碱基组成，所述定量检测核酸片段的所述5’端序列A和所述3’端序列B之间的序列与所述检测样品的核酸靶标序列的所述5’端序列A’和所述3’端序列B’之间的序列的所有碱基排列顺序完全不同(优选不存在连续三个碱基以上，例如，连续4个、5个、6个、7个碱基以上相同的排列序列，优选8-30个碱基排序不同)，/n优选地，在所述1个或多个定量检测核酸片段与所述荧光蛋白之间彼此通过接头连接，更优选地，所述接头长度为6-800bp，优选20-800bp或6-200bp，优选地，所述接头含转录控制元件，包括但不限于如CMV(promoter)、IRES(核糖体结合位点)。/n...

【技术特征摘要】
20200310 CN 20201016053841.模拟病毒载体，其特征在于以病毒(优选慢病毒或腺病毒)骨架为载体，在慢病毒骨架中包含一个或多个定量检测核酸片段和用于示踪的荧光蛋白的编码基因，
所述定量检测核酸片段的长度与检测样品的核酸靶标序列长度相同，且与所述检测样品的核酸靶标序列含有相同百分比的碱基组成，其中定量检测核酸片段的5’端序列A和3’端序列B与检测样品的核酸靶标序列的相应5’端序列A’和3’端序列B’的序列相同或不相同，其中序列A由用于扩增检测样品的核酸靶标序列的5’端引物序列与其临近下游2个碱基组成，序列B由用于扩增检测样品的核酸靶标序列的3’端引物序列与其临近上游2个碱基组成，所述定量检测核酸片段的所述5’端序列A和所述3’端序列B之间的序列与所述检测样品的核酸靶标序列的所述5’端序列A’和所述3’端序列B’之间的序列的所有碱基排列顺序完全不同(优选不存在连续三个碱基以上，例如，连续4个、5个、6个、7个碱基以上相同的排列序列，优选8-30个碱基排序不同)，
优选地，在所述1个或多个定量检测核酸片段与所述荧光蛋白之间彼此通过接头连接，更优选地，所述接头长度为6-800bp，优选20-800bp或6-200bp，优选地，所述接头含转录控制元件，包括但不限于如CMV(promoter)、IRES(核糖体结合位点)。


2.权利要求1所述的模拟病毒载体，其中所述检测样品的核酸靶标序列来自生物体，所述生物体选自病毒、细菌、真菌、植物、动物(包括低等动物和高等动物，优选地，低等动物包括但不限于线虫、果蝇，高等动物包括但不限于马哈鱼、斑马鱼和哺乳动物，更优选地，所述哺乳动物包括但不限于人、猩猩、猴子、鼠)。


3.权利要求2所述的模拟病毒载体，其中所述病毒选自DNA病毒(如单纯疱疹病毒，甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，人乳头瘤病毒，腺病毒，HPV)或RNA病毒(如丙型肝炎病毒，人类免疫缺陷病毒，冠状病毒，流感病毒如禽流感病毒或猪流感病毒)；所述细菌包括但不限于肺结核、淋病、炭疽病、梅毒、鼠疫、沙眼等，所述真菌选自但不限于霉菌、酵母、块菌以及其他人类所熟知的菌菇类；
优选所述冠状病毒选自SARS病毒，MERS病毒和SARS-CoV-2病毒。


4.权利要求3所述的模拟病毒载体，其特征在于，定量检测核酸片段的长度为80bp-60kb，优选80bp-19.5kb，80bp-17.5kb，80bp-1.5kb，80bp-1kb，80bp-500bp，更优选地80bp-200bp，并且所述定量检测核酸片段及定量检测核酸片段之间的接头序列的总长度不超过8.5kb，8kb或7kb。


5.权利要求1-4任一项所述模拟病毒载体，其中所述慢病毒载体为lentivirus病毒载体(优选pEZ-Lv201)或FIV病毒载体。


6.权利要求1-5任一项所述模拟病毒载体，其中所述慢病毒载体包括但不限于二代、三代慢病毒载体。


7.权利要求5或6所述的模拟病毒载体，其中当所述检测样品的核酸来自SARS-CoV-2时，所述检测样品的核酸靶标序列为选自下述编码基因的至少2种：Orf1ab编码基因全长或其片段、S蛋白编码基因全长或其片段、E蛋白编码基因全长或其片段、N蛋白编码基因全长或其片段。


8.权利要求7所述的模拟病毒载体，其中
所述定量检测核酸片段选自下述一种或多种：
检测靶向序列1(对应检测样品的Orf1ab编码基因片段)包括选自SEQIDNO：1至SEQIDNO：2的序列或其组合或至少由选自SEQIDNO：1至SEQIDNO：2的序列或其组合组成；
检测靶向序列2(对应检测样品的S蛋白编码基因片段)包括或至少由SEQIDNO：3序列组成；
检测靶向序列3(对应检测样品的E蛋白编码基因片段)包括或至少由SEQIDNO：4序列组成；
检测靶向序列4(对应检测样品的N蛋白编码基因片段)包括选自以下SEQIDNO：5至SEQIDNO：8的序列或其任意组合或至少由选自以下SEQIDNO：5至SEQIDNO：8的序列或其任意组合组成。


9.权利要求8所述的模拟病毒载体，其中所述模拟病毒的序列SEQIDNO：9。


10.利用权利要求1-9任一项的模拟病毒载体制备的模拟病毒颗粒，优选将所述模拟病毒载体转染到人293T细胞株中来制备所述模拟病毒颗粒。


11.权利要求1-9任一项所述的模拟病毒载体或权利要求10所述的模拟病毒颗粒在选自以下用途中的应用：
(...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨淑伟，黄连成，冯菲菲，粟龙稳，林坤，唐灿，梁晨，汪元梅，蔡艳清，庞艺琳，沈川，余治学，
申请(专利权)人：广州复能基因有限公司，广州易锦生物技术有限公司，美国锦可贝生物技术公司，
类型：发明
国别省市：广东;44