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一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其应用技术方案

技术编号:28660998 阅读:34 留言:0更新日期:2021-06-02 02:34
本发明专利技术提供了一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其应用,属于抗病毒药物技术领域。本发明专利技术通过密码子优化新冠病毒S1蛋白中的RBD区域蛋白的编码序列插入载体中,再利用乳酸杆菌安全高效地表达,得到重组表达S1蛋白,使其能作为粘膜感染阻断喷剂,与人体呼吸道、眼结膜、消化道及其它粘膜表面特异性受体(ACE2)结合,从而使得新冠病毒与机体黏膜表面结合的位点被S1蛋白优先占位封闭,进而高效阻断和干扰新冠病毒与人粘膜特异性受体结合,预防新冠肺炎发生,减少新冠肺炎感染人群数量,快速阻遏其全球漫延。

【技术实现步骤摘要】
一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其应用本申请要求于2020年04月14日提交中国专利局、申请号为202010288793.7、专利技术名称为“一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其应用”的中国专利申请的优先权,其全部内容通过引用结合在本申请中。
本专利技术属于抗病毒药物
,具体涉及一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其应用。
技术介绍
新冠肺炎(COVID-19)是由一种新型冠状病毒(世界卫生组织将其命名为2019-nCOV;国际病毒分类委员会命名为SARS-CoV-2)感染所致。冠状病毒(CoV)为直径80~120nm的正链单股RNA病毒,分为α、β、δ和γ等四个类型。其中,2003年非典(SARS-CoV)和2012年中东呼吸综合征(MERS-CoV)和2019年新冠肺炎病毒都属于β-冠状病毒,均引发了全球的严重的急性呼吸道感染疫病。新冠肺炎病毒(SARS-CoV-2)经中国科学家的研究证实,其基因组包括29891个核苷酸,包含两端非翻译区(untranslatedregions,UTR)基因和一个完整的开放阅读框基因(openreadingframe,ORF),至少可以编码四种结构蛋白:刺突糖蛋白(spike,S)、小包膜糖蛋白(envelope,E)、膜糖蛋白(membrane,M)、核衣壳蛋白(nucleocapsid,N),其基因组序列与MERS-CoV具有较高的同源性。SARS-CoV-2的传播方式主要是以呼吸道飞沫传播为主,极少数是通过气溶胶、粪便等途径传播。如何快速遏制SARS-CoV-2在全球的传播和漫延,一是目前采取的各种生物安全措施,如居家隔离、减少人员流动以及各种消毒措施等,但其难度大,漏洞多,全社会付出的代价巨大,全世界除了中国,到目前为止还没有阻止病毒的快速漫延;二是加快疫苗研制,但疫苗研制周期长,生产工艺技术较复杂,成本较高,注射需要专业技术人员,很难在短时间内达到群体免疫效果。
技术实现思路
有鉴于此,本专利技术的目的在于提供一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其在制备预防新冠病毒感染的药物中的应用,通过阻断和干扰新冠病毒与粘膜特异性受体结合,从而预防和减少新冠肺炎,快速阻遏其全球漫延。本专利技术提供了一种用于防治新冠病毒感染的重组载体,包括密码子优化的新冠病毒S1蛋白中RBD区域蛋白的编码序列;所述编码序列的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。优选的,所述重组载体的基础载体包括乳酸杆菌分泌型表达载体。优选的,所述乳酸杆菌分泌型表达载体包括pVE5523。优选的,所述编码序列插入pVE5523中的多克隆位点为SalI和EcoRV。本专利技术提供了一种包含所述重组载体的重组乳酸杆菌表达系统。本专利技术提供了由所述重组乳酸杆菌表达系统中分泌表达的重组S1蛋白。本专利技术提供了所述重组S1蛋白的制备方法,包括以下步骤:将所述重组乳酸杆菌表达系统在无菌环境下接种至乳酸杆菌专用培养基,在28~35℃条件下发酵68~75h,得到的发酵液中含重组S1蛋白。本专利技术提供了所述重组载体、所述重组乳酸杆菌表达系统、权利要求6所述重组S1蛋白或所述制备方法制备的发酵液在制备防治新冠病毒感染的药物中的应用。本专利技术提供了一种防治新冠病毒感染的粘膜阻断剂,包括所述重组S1蛋白或所述制备方法得到的重组S1蛋白。优选的,所述粘膜阻断剂包括口、鼻喷剂或滴眼液。本专利技术提供的用于防治新冠病毒感染的重组载体和重组乳酸杆菌表达系统,是通过密码子优化新冠病毒S1蛋白中的RBD区域蛋白的编码序列插入载体中,再利用乳酸杆菌安全高效地表达,得到重组表达S1蛋白,使其能作为粘膜感染阻断喷剂,与人体呼吸道、眼结膜、消化道及其它粘膜表面特异性受体(ACE2)结合,从而新冠病毒与机体黏膜表面结合的位点被S1蛋白优先占位封闭,进而高效阻断和干扰新冠病毒与人粘膜特异性受体(ACE2)结合,从而预防新冠肺炎发生,减少新冠肺炎感染人群数量,快速阻遏其全球漫延。本专利技术的一种防治新冠病毒感染的粘膜阻断剂。由于SARS-CoV-2的传播方式主要是以呼吸道飞沫传播为主,极少数是通过气溶胶、粪便等传播,切断新冠病毒表面的S1蛋白与呼吸道、眼结膜、消化道及其它粘膜表面ACE2受体的结合,阻断病毒感染路径就可有效降低新冠病毒感染,具有以下特点:1)相比于疫苗,重组新冠病毒S1蛋白,只包含病毒功能性蛋白,无病毒感染基因存在,不会导致病毒变异,且是外用制剂,安全性高;2)重组S1蛋白分泌到胞外,属于可溶性的表达产物,同时乳酸杆菌是人体内常见的益生菌,被公认为最安全的食品级微生物,用乳酸菌表达的S1蛋白无需提取纯化,省去了常规原核表达系统表达后的复杂的纯化过程和复性过程,大大降低了粘膜阻断剂的生产成本,利于快速工业化生产;3)所述粘膜阻断剂可多次重复使用,不仅无毒、无害,而且可诱导粘膜免疫,进一步减少病毒感染风险,可用于专业医务人员上岗前使用,或乘坐密闭交通工具和办公场所使用,或社区、家庭预防感染使用。附图说明图1为重组载体pVE5523-SARS-CoV-2-S1载体图谱;图2为重组载体的测序结果与插入的核苷酸片段进行序列比对结果;图3为重组载体pVE5523-SARS-CoV-2-S1的荧光定量PCR扩增曲线;图4-1为重组S1蛋白WesternBlot鉴定;其中M:Marker26616;1:重组乳酸杆菌上清20μl;2:重组乳酸杆菌沉淀20μl;图4-2为重组S1蛋白考马斯亮蓝染色分析结果;其中,M:Marker26616;1:重组乳酸杆菌上清20μl;2:重组乳酸杆菌沉淀20μl;3:BCA标准品8.8ng/μl;4:BCA标准品17.59ng/μl;5:BCA标准品35.19ng/μl;6:BCA标准品70.375ng/μl;7:BCA标准品140.75ng/μl;8:BCA标准品281.5ng/μl;9:BCA标准品563ng/μl。具体实施方式本专利技术提供了一种用于防治新冠病毒感染的重组载体,包括密码子优化的新冠病毒S1蛋白中RBD区域蛋白的编码序列;所述编码序列的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。在本专利技术中,所述重组载体的基础载体优选包括乳酸杆菌分泌型表达载体。本专利技术对所述乳酸杆菌分泌型表达载体的种类没有特殊限制,采用本领域所熟知的乳酸杆菌分泌型表达载体即可。为了举例说明重组载体的种类,在本专利技术实施例中,所述乳酸杆菌分泌型表达载体为pVE5523。所述编码序列插入pVE5523中的多克隆位点优选为SalI和EcoRV。在本专利技术中,所述编码序列是新冠病毒S1蛋白中RBD区域蛋白按照乳酸杆菌密码子偏好进行优化得到的,同时进行两次重复,有利于提高蛋白表达量,其核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示(gtcgacatgtacctgtatagat本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种用于防治新冠病毒感染的重组载体,其特征在于,包括密码子优化的新冠病毒S1蛋白中RBD区域蛋白的编码序列;所述编码序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。/n

【技术特征摘要】
20200414 CN 20201028879371.一种用于防治新冠病毒感染的重组载体,其特征在于,包括密码子优化的新冠病毒S1蛋白中RBD区域蛋白的编码序列;所述编码序列的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。


2.根据权利要求1所述重组载体,其特征在于,所述重组载体的基础载体包括乳酸杆菌分泌型表达载体。


3.根据权利要求2所述重组载体,其特征在于,所述乳酸杆菌分泌型表达载体包括pVE5523。


4.根据权利要求3所述重组载体,其特征在于,所述编码序列插入pVE5523中的多克隆位点为SalI和EcoRV。


5.一种包含权利要求1~4任意一项所述重组载体的重组乳酸杆菌表达系统。


6.权...

【专利技术属性】
技术研发人员:董伟谢小红文利新王吉胡意李鑫张琳玉马朝阳
申请(专利权)人:文利新董伟
类型:发明
国别省市:湖南;43

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