硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因及其应用，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对异源四倍体甘蓝型油菜中硫苷转运基因BnaA09.GTR2进行编辑，获得了BnaA09.GTR2基因的纯合突变体，所述BnaA09.GTR2基因敲除突变体成熟种子中总硫苷含量显著降低，证明BnaA09.GTR2基因在硫苷从合成部位向种子转运的过程中发挥功能。能够用于油菜种子硫苷性状的改良，为甘蓝型油菜种子低硫苷性状的改良开发提供了理论依据，为以低硫苷性状改良为目标的油菜育种工作提供了一种新的途径。

【技术实现步骤摘要】
硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因及其应用
本专利技术涉及油菜分子育种
，特别涉及一种硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因及其应用。
技术介绍
油菜(Brassicanapus)是十字花科芸薹属植物中的一种重要的油料作物，是世界范围内广泛种植的主要油料作物，也是我国唯一的冬季油料作物。因此，国家把发展油菜生产作为保证食用油安全供应的重点，具有重要的现实意义。我国甘蓝型油菜由于具有抗病、产量高、适应性广、耐逆行性强等特点，成为主要栽培品种。油菜增产主要通过提高单位面积菜籽产量、提高菜籽含油量和扩大种植面积三种途径。油菜育种工作者现在的主要目标是努力提高含油量、产量和品质。硫代葡萄糖苷(硫苷)是一类含氮、硫的植物次生代谢产物。油菜菜籽榨油后的饼粕含丰富的蛋白质，是良好的天然动物饲料。然而硫苷在甘蓝型油菜籽粒中却是一种有害成分，用含有高硫苷及其水解产物的油菜饼粕去饲养禽畜，会对禽畜造成毒害，所以油菜籽粒中硫苷含量的高低决定了油菜饼粕作为饲料的价值。一方面，降低油菜籽粒中硫苷含量是改良菜籽油品质的重要育种目标之一。另一方面，硫苷的水解产物在油菜营养体中却可以对油菜起保护作用。因此，低硫苷油菜自身的抗虫抗病性随着籽粒硫苷含量的下降也显著的降低，不利于双低油菜的推广和应用。通过遗传育种的方法，培育出高叶片硫苷但低籽粒硫苷含量的材料，具有重要的现实意义。植物中硫苷的合成与积累部位并不一致，硫苷首先在嫩叶中大量积累，随着叶片逐渐老化，其硫苷含量下降，种子中的硫苷开始积累。研究表明拟南芥GTR1和GTR2基因在介导硫苷的这种长距离运输过程中起着重要作用。在GTR1和GTR2双突变体中，种子中的硫苷几乎完全消失，而在叶片中积累10倍以上。因此，阻断硫苷从合成部位往种子中运输，对降低种子中硫苷含量、提高植物抗虫抗病性具有重要作用。Nour-Eldin等成功将硫苷转运基因突变的gtr功能丧失表型从模式植物转移到芸苔属作物中，即通过对白菜中7个GTR同源基因中的一个(BrGTR2A2)和芥菜中12个GTR同源基因中的4个(Bj2A1/2A2/2B1/2B2)进行突变，分别使白菜和芥菜种子中的硫苷含量分别降低60-70％。从而证明这种“转运工程(transportengineering)”方法可广泛应用于降低其他油料作物(如异源四倍体油菜)种子硫代葡萄糖苷含量。因此，鉴定油菜GTR同源基因中负责硫苷往种子中转运的关键转运子，对甘蓝型油菜种子硫苷含量性状进行进一步研究，提高菜籽油品质，培育出高叶片硫苷但低籽粒硫苷含量的材料，具有重要意义，同时为揭示甘蓝型油菜中硫苷含量遗传机理和分子机制奠定基础。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术提出了一种硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因及其应用，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对异源四倍体甘蓝型油菜中硫苷转运基因BnaA09.GTR2进行编辑，获得了BnaA09.GTR2基因的纯合突变体，所述BnaA09.GTR2基因敲除突变体成熟种子中总硫苷含量显著降低，证明BnaA09.GTR2基因是调控硫苷从合成部位转运到种子中的重要基因。本专利技术提供硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因，所述BnaA09.GTR2基因的基因组区的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因，所述BnaA09.GTR2基因的编码区的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2蛋白，所述BnaA09.GTR2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，所述氨基酸序列由SEQIDNO.2所示的核苷酸序列编码。本专利技术还提供硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因在油菜分子育种方面的应用，所述BnaA09.GTR2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因在油菜硫苷性状改良方面的应用，所述BnaA09.GTR2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供一种基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体，所述基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体转入甘蓝型油菜能够获得种子中总硫苷含量降低的甘蓝型油菜材料，所述基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体对甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因进行定向编辑，在甘蓝型油菜BnaA09.GTR2外显子区域选取以碱基NGG结尾的DNA片段作为靶位点。进一步的，所述靶位点的一条链具有5’-(N)XNGG-3’结构，其中(N)X中的X表示数目为X的一条碱基序列，(N)X中的N代表碱基A、G、C、T中的任意一种，X为19或20；优选的，所述靶位点序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示。本专利技术还提供一种种子中总硫苷含量降低的甘蓝型油菜材料，所述甘蓝型油菜材料中的BnaA09.GTR2基因被敲除，所述基因敲除方法为CRISPR/Cas9基因编辑系统、EMS诱变、同源重组、T-DNA插入中的任意一种。本专利技术还提供一种重组菌株，所述重组菌株中转入了所述的基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体。本专利技术还提供所述的基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体在降低油菜种子中总硫苷含量中的应用，将所述基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体转化微生物培养表达，转化目标植物，获得BnaA09.GTR2基因敲除突变体，所述转化方式为农杆菌介导、花粉管通道法、基因枪法、显微注射法中的任意一种。本专利技术还提供一种降低油菜种子中总硫苷含量的方法，所述方法包括在油菜中转入所述的基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体，获得BnaA09.GTR2基因敲除突变体。综上，与现有技术相比，本专利技术达到了以下技术效果：(1)本专利技术鉴定到甘蓝型油菜中一个重要硫苷转运基因BnaA09.GTR2，该基因对硫苷从合成部位往种子中运输起重要作用，为油菜种子低硫苷、叶片高硫苷的育种工作提供了一种全新的途径，具有广阔的应用前景。(2)本专利技术鉴定了一个能改变甘蓝型油菜种子硫苷含量的重要转运子，并提供一个基于CRISPR/Cas9系统的靶位点，该靶位点可以定点编辑BnaA09.GTR2基因；通过CRISPR/Cas9系统获得甘蓝型油菜的种子低硫苷种质，为种子低硫苷的抗病种质的育种工作提供了一种全新的途径，具有广阔的应用前景。(3)本专利技术利用基因编辑技术，将BnaA09.GTR2基因在甘蓝型油菜中特异敲除，经硫苷含量测定证明，与受体甘蓝型油菜相比，BnaA09.GTR2敲除突变体种子中硫苷的含量显著降低，证明BnaA09.GTR2在硫苷向种子中转运、硫苷在种子中积累的过程中起重要作用，这一发现不仅丰富了对甘蓝型油菜硫苷转运机制的认识，而且为甘蓝型油菜种子低硫苷育种的培育提供了理论依据。(4)本专利技术利用基因编辑技术，将BnaA09.GTR2基因在甘蓝型油菜中特异敲除，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因，其特征在于，所述BnaA09.GTR2基因的基因组区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因，其特征在于，所述BnaA09.GTR2基因的基因组区的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因，其特征在于，所述BnaA09.GTR2基因的编码区的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2蛋白，其特征在于，所述BnaA09.GTR2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，所述氨基酸序列由SEQIDNO.2所示的核苷酸序列编码。


4.硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因在油菜分子育种方面的应用，其特征在于，所述BnaA09.GTR2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


5.硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因在油菜硫苷性状改良方面的应用，其特征在于，所述BnaA09.GTR2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


6.一种基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体，所述基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体转入甘蓝型油菜能够获得种子中总硫苷含量降低的甘蓝型油菜材料，其特征在于，所述基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体对甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因进行定向编辑，在甘蓝型油菜BnaA09.GTR2外显子区域选取以碱基NGG结尾的DNA片段作为靶位点。...

【专利技术属性】
技术研发人员：张园园，何贻洲，刘胜毅，刘越英，黄军艳，程晓辉，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42