一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法及获得的突变菌株，具体涉及非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)的突变。具体步骤包括：制备野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液；对野生型非洲哈茨木霉进行3轮诱变；诱变菌株的筛选；优良突变株酶活稳定性的测定。通过3轮自适应诱变对菌株进行诱变处理，诱变目的性强、实用性高。本发明专利技术方法最终诱变筛选获得一株纤维素酶活显著提升(FPA提升3.17倍、CMCase提升4.77倍、pNPCase提升3.86倍、pNPGase提升2.97倍)且遗传性状稳定的突变株MEA‑12，在工业纤维素酶制剂生产中具有重要价值。

【技术实现步骤摘要】
一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法
本专利技术属于工业微生物
，具体涉及一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法及其获得的突变菌株。
技术介绍
纤维素在自然界中分布广泛，是最有前景的生物转化原材料之一。作为传统化石能源的理想替代品，来自纤维素类生物质的纤维燃料乙醇引起各国的关注。纤维燃料乙醇可以通过热化学方法以及生物化学方法生产。纤维素酶是将纤维素类生物质转化为可发酵糖以生产燃料乙醇的关键。此过程中使用的纤维素酶是复合酶，即含内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)，根据C1-Cx假说，上述3种纤维素酶协同作用将纤维素转化为葡萄糖。目前，已知能够产生纤维素酶的微生物有细菌、真菌、放线菌。丝状真菌与其它微生物来源相比具有更高的分泌能力而被认为是最有潜力的纤维素酶生产菌。通过自然选育获得的丝状真菌大多酶活性较低、酶系不全，远不能满足工业生产要求，所以选育高纤维素酶产量和质量的菌株是拓展纤维素酶应用范围的根本。非定向诱变育种方法因其适用广泛、操作简单、成本低廉等优点成为微生物育种的重要途经。诱变育种技术根据所用诱变介质的不同，主要分为物理诱变和化学诱变。然而，不同诱变介质的优缺点不一，化学诱变剂的使用能大幅度提高目标菌株酶活，但所得突变株在传代过程中易发生回复突变，同样的情况也经常存在于紫外诱变过程中(光复活修复，PhotoreactivationRepair)，而ARTP与重离子体此类诱变源所得突变株的遗传稳定性良好但酶活的提升幅度却不高，如何权衡突变体正向突变率与遗传稳定性是今后研究过程中的一大重点。此外，单轮诱变与多轮诱变也会影响最终诱变效果，单一诱变技术的重复处理往往会降低突变效率。此外，针对非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)进行有效突变获得高产纤维素酶的菌株也非常困难。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有诱变技术的不足之处，提供了一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法，解决了上述
技术介绍
中的问题。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：提供了一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法，包括如下步骤：(1)将野生型非洲哈茨木霉进行试管斜面培养；在步骤(1)中，所述野生型非洲哈茨木霉购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC40189；所述野生型非洲哈茨木霉试管斜面培养的条件为在28℃，培养5～7d；所述野生型非洲哈茨木霉的培养基为查氏培养基：蔗糖30.0g，NaNO33.0g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO4·4H2O0.01g，K2HPO41.0g，琼脂15.0g，加去离子水定容至1.0L，pH6.0～6.5，121℃灭菌20min。(2)制备野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液；在步骤(2)中，所述制备野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液的具体方法为：取培养5～7d的野生型非洲哈茨木霉试管斜面，加入适量1％生理盐水，冲洗后转移至含100mL1％生理盐水的250mL锥形瓶，锥形瓶中含玻璃珠若干，30℃、180rpm振荡15min，将液体转移至另一250mL空锥形瓶，锥形瓶中含玻璃珠若干、瓶颈填充脱脂棉，30℃、180rpm振荡15min，用血球计数板计数，调整孢子数量为1×107～1×108个/mL，即得野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液，以上试剂耗材均做灭菌处理。(3)对野生型非洲哈茨木霉进行3轮诱变；在步骤(3)中，所述对野生型非洲哈茨木霉进行3轮诱变的具体方法为：1)甲基硝基亚硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)诱变：取0.1g98％MNNG试剂溶解于1mL丙酮配制成10％MNNG溶液；用移液枪移取970μL野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液与30μL10％MNNG溶液，置于恒温摇床中，30℃、180rpm振荡处理，选择处理时间为0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min；诱变处理结束后，12000rpm离心3min弃上清，1％生理盐水洗涤沉淀2次，制成新的孢子悬浮液；取100μL诱变后孢子悬浮液涂布至改良CMC-Na平板，30℃恒温培养3～5d；2)甲基磺酸乙酯(Ethylmethylsulfonate，EMS)诱变：取99％EMS试剂与丙酮按体积比1:1混匀配制成50％EMS溶液；用移液枪移取970μL上一轮诱变后非洲哈茨木霉孢子悬浮液与30μL50％EMS溶液，置于恒温摇床中，30℃、180rpm振荡处理，选择处理时间为0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min；诱变处理结束后，12000rpm离心3min弃上清，1％生理盐水洗涤沉淀2次，制成新的孢子悬浮液；取100μL诱变后孢子悬浮液涂布至改良七叶苷平板，30℃恒温培养3～5d；3)常压室温等离子体(AtmosphericRoomTemperaturePlasma，ARTP)诱变：将ARTP-IIS型诱变育种仪紫外消杀15～30min并预热15～30min；用移液枪移取10μL上一轮诱变后非洲哈茨木霉孢子悬浮液均匀涂抹于载片上，置于诱变育种仪中辐射处理，选择处理时间为0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s、240s、270s；诱变处理结束后，将载片取出置于装有1mL1％生理盐水的EP管中，涡旋充分振荡均匀，制成新的孢子悬浮液；取100μL诱变后孢子悬浮液涂布至改良MCC平板，30℃恒温培养3～5d。(4)每轮诱变过程中诱变致死率与正突变率的计算；在步骤(4)中，所述诱变致死率的计算公式为：致死率(％)＝(空白对照平板菌落数-诱变平板菌落数)/空白对照平板菌落数×100％所述正突变率的计算公式为：正突变率(％)＝表观正突变菌落数/诱变平板菌落数×100％。(5)诱变菌株的初筛与复筛；在步骤(5)中，所述诱变菌株的初筛与复筛的具体方法为，初筛：第1轮诱变结束后，在长有菌落的改良CMC-Na平板上覆盖1mg/mL刚果红溶液，15min～30min后倒去刚果红溶液，加入1mol/LNaCl溶液，15min～30min后倒去NaCl溶液，挑选透明圈直径与菌落直径比值高于出发菌株的菌落，即表观正突变菌落；第2轮诱变结束后，在长有菌落的改良七叶苷平板上挑选颜色深且直径大的菌落，即表观正突变菌落；第3轮诱变结束后，在长有菌落的改良MCC平板上挑选透明圈直径与菌落直径比值高于出发菌株的菌落，即表观正突变菌落；复筛：将表观正突变菌落接种于种子培养基，置于恒温摇床中，30℃、180rpm振荡培养2～4d，按10％接种量将种子接种至产酶发酵培养基，置于恒温摇床中，30℃、180rpm振荡培养6～8d，10000rpm离心取上清，参照GBT35808-201本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法，其特征在于包括如下步骤：/n(1)制备野生型非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)孢子悬浮液；优选地，所述野生型非洲哈茨木霉购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC40189；/n(2)对野生型非洲哈茨木霉进行3轮诱变：/n1)甲基硝基亚硝基胍诱变，诱变处理结束后，制成新的孢子悬浮液；取诱变后孢子悬浮液涂布至改良CMC-Na平板培养3～5d，计算诱变致死率与正突变率；诱变时间控制在50～70min，其诱变致死率均≥99％；/n2)甲基磺酸乙酯诱变，诱变处理结束后，制成新的孢子悬浮液；取诱变后孢子悬浮液涂布至改良七叶苷平板，恒温培养3～5d，计算诱变致死率与正突变率；诱变时间控制在60～80min，其诱变致死率均≥99％；/n3)常压室温等离子体诱变，诱变处理结束后，制成新的孢子悬浮液；取诱变后孢子悬浮液涂布至改良MCC平板，恒温培养3～5d，计算诱变致死率与正突变率；诱变时间控制在210～270s，三轮诱变后的诱变致死率，其诱变致死率均≥99％；/n(3)诱变菌株的筛选；/n(4)优良突变株酶活稳定性的测定。/n...

【技术特征摘要】
1.一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)制备野生型非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)孢子悬浮液；优选地，所述野生型非洲哈茨木霉购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC40189；
(2)对野生型非洲哈茨木霉进行3轮诱变：
1)甲基硝基亚硝基胍诱变，诱变处理结束后，制成新的孢子悬浮液；取诱变后孢子悬浮液涂布至改良CMC-Na平板培养3～5d，计算诱变致死率与正突变率；诱变时间控制在50～70min，其诱变致死率均≥99％；
2)甲基磺酸乙酯诱变，诱变处理结束后，制成新的孢子悬浮液；取诱变后孢子悬浮液涂布至改良七叶苷平板，恒温培养3～5d，计算诱变致死率与正突变率；诱变时间控制在60～80min，其诱变致死率均≥99％；
3)常压室温等离子体诱变，诱变处理结束后，制成新的孢子悬浮液；取诱变后孢子悬浮液涂布至改良MCC平板，恒温培养3～5d，计算诱变致死率与正突变率；诱变时间控制在210～270s，三轮诱变后的诱变致死率，其诱变致死率均≥99％；
(3)诱变菌株的筛选；
(4)优良突变株酶活稳定性的测定。


2.根据权利要求1所述的一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法，其特征在于在步骤(1)之前还包括所述野生型非洲哈茨木霉试管斜面培养，其培养条件为在28℃，培养5～7d；所述野生型非洲哈茨木霉的培养基为查氏培养基：蔗糖30.0g，NaNO33.0g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO4·4H2O0.01g，K2HPO41.0g，琼脂15.0g，加去离子水定容至1.0L，pH6.0～6.5，121℃灭菌20min。


3.根据权利要求2所述的一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法，其特征在于在步骤(1)中，所述制备野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液的具体方法为：取培养5～7d的野生型非洲哈茨木霉试管斜面，加入适量1％生理盐水，冲洗后转移至含生理盐水的锥形瓶，锥形瓶中含玻璃珠，30℃、180rpm振荡15min，将液体转移至另一空锥形瓶，锥形瓶中含玻璃珠若干、瓶颈填充脱脂棉，30℃、180rpm振荡15min，用血球计数板计数，调整孢子数量为1×107～1×108个/mL，即得野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液。


4.根据权利要求1所述的一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法，其特征在于在步骤(2)中，所述对野生型非洲哈茨木霉进行3轮诱变的具体方法为：
1)甲基硝基亚硝基胍诱变：取0.1g98％MNNG试剂溶解于1mL丙酮配制成10％MNNG溶液；用移液枪移取970μL野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液与30μL10％MNNG溶液，置于恒温摇床中，30℃、180rpm振荡处理不同时间；诱变处理结束后，12000rpm离心3min弃上清，1％生理盐水洗涤沉淀2次，制成新的孢子悬浮液；取100μL诱变后孢子悬浮液涂布至改良CMC-Na平板，30℃恒温培养3～5d；
2)甲基磺酸乙酯诱变：取99％EMS试剂与丙酮按体积比1:1混匀配制成50％EMS溶液；用移液枪移取970μL上一轮诱变后非洲哈茨木霉孢子悬浮液与30μL50％EMS溶液，置于恒温摇床中，30℃、180rpm振荡处理不同时间；诱变处理结束后，12000rpm离心3min弃上清，1％生理盐水洗涤沉淀2次，制成新的孢子悬浮液；取100μL诱变后孢子悬浮液涂布至改良七叶苷平板，30℃恒温培养3～5d；
3)常压室温等离子体诱变：将ARTP-IIS型诱变育种仪紫外消杀15～30min并预热15～30min；用移液枪移取10μL上一轮诱变后非洲哈茨木霉孢子悬浮液均匀涂抹于载片上，置于诱变育种仪中，辐射处理不同时间；诱变处理结束后，将载片取出置于装有1mL1％生理盐水的EP管中，涡旋充分振荡均匀，制成新的孢子悬浮液；取100μL诱变后孢子悬浮液涂布至改良MCC平板，30℃恒温培养3～5d。


5.根据权利要求1所述的一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法，其特征在于在步骤(2)中，所述改良CMC-Na平板配方为：CMC-Na10.0g，尿素0.3g，胰蛋白胨0.75g，酵母提取物0.25g，(NH4)2SO41.4g，KH2PO42.0g，CaCl20.3g，MgSO4·7H2O0.3g，TritonX-1002.0g，2-脱氧-D-葡萄糖5.0g，琼脂20.0g，Mandels微量元素营养盐1.0mL，加去离子水定容至1.0L，pH自然，121℃灭菌20min；所述改良七叶苷平板配方为：七叶苷3.0g，柠檬酸铁0.5g，尿素0.3g，胰蛋白胨0.75g，酵母提取物0.25g，(NH4)2SO41.4g，KH2PO42.0g，CaCl20.3g，MgSO4·7H2O0.3g，TritonX-1002.0g，2-脱氧-D-葡萄糖10.0g，琼脂20.0g，Mandels微量元...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪海，彭志清，吴升山，李闯，唐兴，孙勇，林鹿，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35