一种诱导型碱基编辑系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种诱导型碱基编辑系统及其应用。该碱基编辑系统包括可诱导的人来源胞嘧啶脱氨酶(A3A)与单切口活性的SpCas9组成；脱氨酶能基于潜在的氨基酸位点进行拆分；雷帕霉素通过FRB/FKBP与氨基酸拆分位点的N端和C端相互作用而重组装分裂的脱氨酶，并诱导完成碱基编辑。本申请通过构建诱导型碱基编辑系统来控制其碱基编辑活性，从而减少脱靶编辑；同时，本申请中的拆分设计不会减少目标编辑，因此，可以作为蛋白质突变的补偿策略，并且可以与这些突变的脱氨酶结合使用，以进一步减少脱靶编辑。

【技术实现步骤摘要】
一种诱导型碱基编辑系统及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种诱导型碱基编辑系统及其应用。
技术介绍
碱基编辑是一种基因组编辑策略，可直接在基因组DNA中转换特定的单个核苷酸(ReesandLiu2018)。目前，碱基编辑器有两种类型，胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，两者都由脱氨酶与催化缺陷的Cas9蛋白组成，该酶可催化胞嘧啶或腺嘌呤的脱氨反应。在sgRNA的指导下，碱基编辑器可以在靶点内特定窗口的几个碱基对中将C-G碱基对转换为T-A碱基对，或将A-T碱基对转换为G-C碱基对。因为它高效且精确，并且不会产生由DNA双链断裂(DSB)引入的插入或缺失等副产物，所以该技术很快被广泛用于各种模式生物中，例如小鼠，斑马鱼，拟南芥和酿酒酵母。尽管碱基编辑技术在广泛的基础研究中取得了许多令人振奋的成果，但是碱基编辑在临床应用中仍然存在一个主要阻碍，即在DNA或RNA水平上的脱靶效应。当前的CBE和ABE通常会引起RNA中全转录组范围内的脱靶，引起了对安全性问题的关注。更严重的是，由于CBE还会造成DNA水平的脱靶，可能进一步导致包括癌症在内的病理状况。实际上，早在三十多年前，研究人员发现过表达APOBEC1(CBE中使用的最流行的胞嘧啶脱氨酶之一)可导致转基因小鼠患上肝癌。随后，AID也被发现在小鼠中过表达会诱导肿瘤的发生。基于这些发现，越来越多的研究证实了胞嘧啶脱氨酶与多种组织中的肿瘤发生之间的联系。已发现的胞嘧啶脱氨酶的成员中，如APOBEC3B，在多种实体瘤。已发现胞嘧啶脱氨酶的过表达能够诱导基因组DNA中的碱基替换，从而损害基因组稳定性。更重要的是，已发现许多肿瘤细胞带有以胞嘧啶标记为特征的SNV。因此，不受控制的碱基编辑器(尤其是CBE)可能会产生肿瘤。考虑到AAV是目前最有效的体内传递载体之一，AAV注射后会使转基因在体内长期表达，使用这种载体传递碱基编辑器无疑会放大脱靶后果。因此，我们迫切需要探索活性可控的新型碱基编辑工具。
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种诱导型碱基编辑系统及其应用，通过构建拆分式碱基编辑系统，并能通过雷帕霉素的诱导来控制其碱基编辑活性，通过该方案能够有望缩短编辑时间。同时，本申请中的拆分设计不会减少目标编辑，因此，可以作为蛋白质突变的补偿策略，并且可以与这些突变的脱氨酶结合使用，以进一步减少脱靶编辑。近年来，许多研究表明碱基编辑器存在的DNA和RNA的脱靶效应。本专利技术通过控制脱氨酶活性进而控制碱基编辑器的编辑编辑活动，从而降低脱靶效应。本专利技术的碱基编辑系统包括可诱导的人源胞嘧啶脱氨酶(A3A)与单切口活性的SpCas9。具体方案为：将A3A分裂为失活的N端和C端后，分别与FRB和FKBP蛋白融合，FRB和FKBP在雷帕霉素诱导下形成稳定的三元复合物，从而使脱氨酶重新组装成有功能性的A3A。由于脱氨酶的活性可受诱导剂调控，进而该碱基编辑器的活性是可控的。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种诱导型碱基编辑系统，碱基编辑系统包括碱基编辑器，以及与其结合的雷帕霉素；碱基编辑器包括脱氨酶；脱氨酶能基于任一氨基酸位点进行拆分；雷帕霉素通过拆分后的氨基酸位点与脱氨酶结合，并诱导完成碱基编辑。进一步地，碱基编辑器为由脱氨酶和BE3/SpCas9组成的碱基编辑器。进一步地，雷帕霉素的FRB和FKBP分别与脱氨酶氨基酸拆分位点的非结构性环的分裂处偶联。进一步地，FRB和FKBP分别与脱氨酶氨基酸拆分位点的N端和C端融合，并二聚化形成异二聚体，完成碱基编辑器的组装。进一步地，脱氨酶的拆分位点为第44位、85位、118位或147位氨基酸。进一步地，脱氨酶的拆分位点为第85位氨基酸。进一步地，脱氨酶为胞嘧啶脱氨酶。进一步地，胞嘧啶脱氨酶为APOBEC3A胞嘧啶脱氨酶或APOBEC1胞嘧啶脱氨酶。进一步地，雷帕霉素的浓度为0.01～200nM。进一步地，雷帕霉素的浓度为200nM。上述诱导型碱基编辑系统在基因编辑中的应用。一种用于进行基因编辑的试剂盒，包括上述诱导型碱基编辑系统。本申请构建得到的碱基编辑系统能够使得Cas9保持完整，因此它能与其他非传统的碱基编辑器兼容，例如CP-Cas9衍生的碱基编辑器(Huang等，2019)，内部镶嵌的BE-PIGS碱基编辑(Wang等人，2019)和sgRNA骨架修饰的sgBEs(Wang等人，2020)。本专利技术的有益效果为：本申请通过构建拆分式碱基编辑系统，并能通过雷帕霉素的诱导来控制其碱基编辑活性，通过该方案能够有望缩短编辑时间。同时，本申请中的拆分设计不会减少目标编辑，因此，可以作为蛋白质突变的补偿策略，并且可以与这些突变的脱氨酶结合使用，以进一步减少脱靶编辑。附图说明图1为诱导型split-A3A-BE3的设计流程图；图2为4个split-A3A-BE3的可诱导编辑活性检测结果；图3为雷帕霉素的作用浓度和持续时间对sA3A-BE3-85的碱基编辑的影响检测结果；图4为sA3A-BE3-85的编辑模式的特征检测；图5为sA3A-BE3-85的DNA脱靶编辑检测结果；图6为通过ERT2系统控制sA3A-BE3-85的亚细胞定位减少背景编辑的检测结果；图7为split-APOBEC1-BE3的构建过程和特性检测。具体实施方式下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本专利技术构思的专利技术创造均在保护之列。实施例1构建split-A3A质粒在A3A-BE3的基础上中构建了split-A3A质粒，以形成一系列的N端split-A3A及其对应的C端split-BE3-A3As(图1b)。如图1c所示，构建了4组split-A3A-BE3(sA3A-BE3)，并以其氨基酸拆分位点命名，即sA3A-BE3-44，sA3A-BE3-85，sA3A-BE3-118和sA3A-BE3分别为-147。图1为诱导型split-A3A-BE3的设计；其中，图a显示了诱导型split-A3A-BE3重组装示意图，雷帕霉素诱导分别与A3A的N端和C端融合的FRB和FKBP的二聚化从而形成异二聚体，从而完成功能性A3A-BE3碱基编辑器的组装。图b为A3A结构的示意图(PDB：5keg)。与ssDNA-A3A结合界面相对的四个非结构性环是候选的分裂位点，在图中以球状表示。图c为split-A3A-BE3胞嘧啶碱基编辑器的构建示意图。实施例2split-A3A碱基编辑1、sA3A-BE3可诱导的碱基编辑活性检测在3个内源性靶点中，将每对split-A3A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导型碱基编辑系统，其特征在于，所述碱基编辑系统包括碱基编辑器，以及与其结合的雷帕霉素；所述碱基编辑器包括脱氨酶；/n所述脱氨酶能基于任一氨基酸位点进行拆分；所述雷帕霉素通过拆分后的氨基酸位点与脱氨酶结合，并诱导完成碱基编辑。/n

【技术特征摘要】
1.一种诱导型碱基编辑系统，其特征在于，所述碱基编辑系统包括碱基编辑器，以及与其结合的雷帕霉素；所述碱基编辑器包括脱氨酶；
所述脱氨酶能基于任一氨基酸位点进行拆分；所述雷帕霉素通过拆分后的氨基酸位点与脱氨酶结合，并诱导完成碱基编辑。


2.根据权利要求1所述的诱导型碱基编辑系统，其特征在于，所述雷帕霉素的FRB和FKBP分别与脱氨酶氨基酸拆分位点的非结构性环的分裂处偶联。


3.根据权利要求2所述的诱导型碱基编辑系统，其特征在于，所述FRB和FKBP分别与脱氨酶氨基酸拆分位点的N端和C端融合，并二聚化形成异二聚体，完成碱基编辑器的组装。


4.根据权利要求1所述的诱导型碱基编辑系统，其特征在于，所述脱氨酶的拆分位点为第44位、85位、118位或147位氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚少华，龙洁，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51