本发明专利技术涉及一种维生素D3产量提高的酵母菌，本发明专利技术利用dCas9系统动态调控ERG6基因，该系统的引入可以将酿酒酵母细胞分为前期细胞生长阶段和后期产物积累阶段。前期dCas9系统不发挥对ERG6基因的抑制作用，细胞实现正常生长繁殖，后期当OD进入较高水平时，dCas9系统发挥动态调控作用，抑制ERG6基因的正常转录，阻断7‑DHC的竞争途径，实现代谢流更大限度的流向目标产物。同时保证了细胞的正常生长繁殖，发酵产量达到123mg/L。
【技术实现步骤摘要】
一种维生素D3产量提高的酵母菌
本专利技术属于代谢工程
，尤其涉及一种维生素D3产量提高的酵母菌。
技术介绍
维生素D(VitaminD,VD)，被称为“阳光维生素”，是维持机体健康所必需的一种脂溶性维生素。麦角钙化醇(Ergocalciferol,VD2)和胆钙化醇(Cholecalciferol,VD3)是VD系列化合物中主要的两种存在形式。人体皮肤组织内含有大量的7-脱氢胆固醇(7-DHC)，经紫外光照射后，7-DHC会转变为VD3，是人体获得VD最主要的来源。VD是骨骼正常生长发育的所需的重要营养物质。当人体缺乏VD时则会导致佝偻病、骨质软化等疾病。维生素D不仅能够促进钙磷吸收，还能作用于大脑神经，预防精神分裂症、自闭、认知障碍和神经退化等疾病，同时适当补充VD可有效的治疗和预防糖尿病。此外越来越多的实验证明VD在治疗免疫性系统疾病、癌症以及心血管疾病等方面也具有良好的生理作用。近年来，采用微生物发酵生产目的产物具有绿色环保可持续的特点，维生素D3微生物发酵方法主要集中于菌株的筛选和分子改造方面，菌株筛选费时费力，需要进行大规模的筛选，即使筛选到生产维生素D3的菌株，其初始产物浓度也是极低的，并且不利于后期的改造和工业化生产。分子改造方面主要集中于分支路径的消除，前体物质的供应，但极容易造成有毒中间产物的积累，不利于菌株的生长和生产。现有生产7-DHC的技术主要集中在增强胞质的甲羟戊酸途径，敲除麦角甾醇合成路径中的ERG5和ERG6，实现酿酒酵母中7-DHC的积累，进一步地实现VD3的积累。麦角固醇是酿酒酵母细胞膜的重要组成成分，决定着结构膜的流动性和渗透性。ERG6基因的敲除导致麦角固醇合成受阻，从而产生细胞生长缓慢、游离的NADH/NAD+比例升高，胞内氧化还原失衡、甘油，乙醇积累、脂质代谢失衡等问题。鉴于上述原因，本专利技术人积极加以研究创新，以期创建一种提高维生素D3产量的方法，使其更具有产业上的利用价值。
技术实现思路
为解决维生素D3发酵产量较低的问题，本专利技术提供了一种提高维生素D3的基因工程菌及其构建方法与应用，该构建方法是以酿酒酵母BY4742为出发菌株，引入外源基因DHCR24基因，在酵母细胞中构建7-DHC合成途径，维生素D3发酵产量达到0.7mg/L。利用诱导型启动子GAL过表达MVA途径8个关键基因(ERG10、ERG13、ERG12、ERG20、tHMG1、IDI、ERG8、ERG19)，发酵产量达到57.6mg/L。利用诱导型启动子GAL过表达后角鲨烯途径的4个基因(ERG1、ERG11、ERG7、ERG24)，发酵产量达到73mg/L。再利用dCas9系统动态调控ERG6基因，发酵产量达到123mg/L。本专利技术的第一个目的是提供一种维生素D3产量提高的酵母菌，其在酵母菌宿主中异源表达了3β-羟基甾醇-D24还原酶DHCR24基因，并过表达了乙酰乙酰辅酶A硫解酶ERG10、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶ERG13、甲羟戊酸激酶ERG12、法尼基焦磷酸合酶ERG20、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶ERG19、鲨烯环氧酶ERG1、甾醇14α-去甲基化酶ERG11、羊毛甾醇合酶ERG7和C-14甾醇还原酶ERG24基因。进一步地，所述的酵母菌中，还采用dCas9系统动态调控甾醇C-24甲基转移酶ERG6基因表达，具体是在酿酒酵母中导入以GAL1为启动子的dCas9蛋白基因片段和gRNA表达片段，所述的gRNA表达片段中含有ERG6基因启动子上的20nt位点。进一步地，所述的20nt位点的核苷酸序列如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。进一步地，所述的dCas9蛋白基因片段和gRNA表达片段导入到酵母菌的106a位点。进一步地，所述的酵母菌为酿酒酵母、毕赤酵母或热带假丝酵母。进一步地，所述的GAL1启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。进一步地，3β-羟基甾醇-D24还原酶DHCR24的编号为ID:424661，乙酰乙酰辅酶A硫解酶ERG10的编号为ID:856079、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶ERG13的编号为ID:854913，甲羟戊酸激酶ERG12的编号为ID:855248，法尼基焦磷酸合酶ERG20的编号为ID：853272，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1的编号为ID:42650，异戊烯基焦磷酸异构酶IDI的编号为ID:855986，磷酸甲羟戊酸激酶ERG8的编号为ID:855260，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶ERG19的编号为ID:855779，鲨烯环氧酶ERG1的编号为ID:853086，甾醇14α-去甲基化酶ERG11的编号为ID:856398，羊毛甾醇合酶ERG7的编号为ID:856470，C-14甾醇还原酶ERG24基因的编号为ID:855441。进一步地，甾醇C-24甲基转移酶ERG6的编号为ID:855003。本专利技术的第二个目的是提供所述的酵母菌在发酵生产维生素D3中的应用。进一步地，所述的应用是将所述的酵母菌种子液在YPD培养基中，在28～32℃、150～300rpm条件下培养。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：本专利技术利用dCas9系统动态调控ERG6基因，该系统的引入可以将酿酒酵母细胞分为前期细胞生长阶段和后期产物积累阶段。前期dCas9系统不发挥对ERG6基因的抑制作用，细胞实现正常生长繁殖，后期当OD进入较高水平时，dCas9系统发挥动态调控作用，抑制ERG6基因的正常转录，阻断7-DHC的竞争途径，实现代谢流更大限度的流向目标产物。同时保证了细胞的正常生长繁殖，发酵产量达到123mg/L。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合详细说明如后。附图说明图1为7-DHC合成途径示意图；图2为重组菌96孔板发酵抑制效果图；图3为重组菌96孔板发酵抑制效果图；图4为重组菌摇瓶发酵抑制效果图。具体实施方式涉及的检测方法：气相-质谱联用检测维生素D3：使用带有FID检测器和Chirasil-DEX-CB色谱柱(Agilent；25m，0.32mm，0.25μm)的AgilentTechnologies7890A仪器进行检测。进样器温度为180℃，载气为氦气，流速为1mL/min，压力为5.8psi。程序从70℃开始，以20℃/min的速率将温度升至150℃，保持3分钟，然后以2℃/min的速度将温度升至190℃，保持3分钟。工程菌的发酵培养：在2mlYPD培养基中接种固体YPD平板上的酿酒酵母工程菌单菌落，30℃，220rpm培养16-20h后，按接种量1％接入含有25mLYPD液体培养基的250mL圆本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种维生素D3产量提高的酵母菌，其特征在于，其在酵母菌宿主中异源表达了3β-羟基甾醇-D24还原酶DHCR24基因，并过表达了乙酰乙酰辅酶A硫解酶ERG10、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶ERG13、甲羟戊酸激酶ERG12、法尼基焦磷酸合酶ERG20、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶ERG19、鲨烯环氧酶ERG1、甾醇14α-去甲基化酶ERG11、羊毛甾醇合酶ERG7和C-14甾醇还原酶ERG24基因。/n
【技术特征摘要】
1.一种维生素D3产量提高的酵母菌，其特征在于，其在酵母菌宿主中异源表达了3β-羟基甾醇-D24还原酶DHCR24基因，并过表达了乙酰乙酰辅酶A硫解酶ERG10、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶ERG13、甲羟戊酸激酶ERG12、法尼基焦磷酸合酶ERG20、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶ERG19、鲨烯环氧酶ERG1、甾醇14α-去甲基化酶ERG11、羊毛甾醇合酶ERG7和C-14甾醇还原酶ERG24基因。
2.根据权利要求1所述的酵母菌，其特征在于，所述的酵母菌中，还采用dCas9系统动态调控甾醇C-24甲基转移酶ERG6基因表达，具体是在酿酒酵母中导入以GAL1为启动子的dCas9蛋白基因片段和gRNA表达片段，所述的gRNA表达片段中含有ERG6基因启动子上的20nt位点。
3.根据权利要求2所述的酵母菌，其特征在于，所述的20nt位点的核苷酸序列如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。
4.根据权利要求2所述的酵母菌，其特征在于，所述的dCas9蛋白基因片段和gRNA表达片段导入到酵母菌的106a位点。
5.根据权利要求1所述的酵母菌，其特征在于，所述的GAL1启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。
6.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，吕雪芹，堵国成，李江华，刘延峰，曲丽莎，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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