结直肠癌检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及肿瘤免疫检测领域，尤其是涉及一种结直肠癌检测试剂盒，本发明专利技术还公开了抗体在制备肿瘤治疗和/或诊断肿瘤试剂中的应用。其应用为用结肠癌、直肠癌患者预后判断、疗效观察、监视肿瘤病灶的转移或复发的诊断提供了一种有效工具。

【技术实现步骤摘要】
结直肠癌检测试剂盒
本专利技术涉及免疫检测
,具体涉及一种结直肠癌检测试剂盒。
技术介绍
结直肠恶性肿瘤是目前世界上最常见的肿瘤之一。在欧美发达国家，其发病率居恶性肿瘤第二位，在世界范围内居第三位，男性仅次于肺癌及胃癌，女性仅次于乳腺癌及宫颈癌。结直肠癌在北美、西欧澳大利亚及新西兰等国家最为常见。在我国，结直肠癌发病率在男性中居于第五位，在女性中也是第五位。与发达国家相比，我国结直肠癌的发病年龄明显提前，中位发病年龄约为45岁。而且，近年来随着生活水平的提高，结直肠癌的发病率继续保持着强劲的上升势头。癌胚抗原(CEA)是一种结构复杂的可溶性糖蛋白，分子量约200kDa，胚胎期主要存在于胎儿的胃肠管、胰腺和肝脏，出生后组织含量很低。在胃肠道恶性肿瘤、乳腺癌、癌及其他恶性肿瘤患者的血清中CEA含量异常升高。其在结直肠癌中的表达最高(60％～90％)，故CEA含量可作为结肠癌、直肠癌患者预后判断、疗效观察、监视肿瘤病灶的转移或复发等均为十分有效的指标，可作为独立预后因子，受到越来越多的重视。目前，国内外己公开了多种抗CEA抗体专利，如W02004032962、W02011034660、W02012l17002、CN103173417等。但仍需要亲和力更高，具有更多优良特性的单克隆抗体。对于结肠癌、直肠癌患者预后判断、疗效观察、监视肿瘤病灶的转移或复发的诊断和科学研究具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于是:针对现有技术存在的不足,提供一种高亲和力的，可用于癌胚抗原检测的CEA抗体。本专利技术提供以下技术方案：一种抗CEA单克隆抗体，由重链和轻链组成，重链和轻链分别包括可变区和恒定区，其中重链可变区选自SEQIDNO:7，轻链可变区选自SEQIDNO:8。本专利技术抗CEA单克隆抗体重轻链可变区共有6个互补决定区。所述抗CEA单克隆抗体的重链可变区3个CDR序列分别为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3；轻链可变区3个CDR序列分别为SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6。本专利技术所述抗CEA单克隆抗体的重链和轻链进一步包含恒定区，所述抗体轻链恒定区进一步包含鼠源κ、λ链序列。所述抗体重链恒定区进一步包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3或IgA或IgM序列。本专利技术的又一目的在于提供一种CEA定量检测试剂盒、其制备方法及应用。所述试剂盒包含上述识别CEA的抗体，用结肠癌、直肠癌患者预后判断、疗效观察、监视肿瘤病灶的转移或复发的诊断。所述CEA定量检测试剂盒,包括抗CEA单克隆抗体包被的酶标板和抗CEA酶标抗体。所述抗CEA酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的本专利技术所述的CEA多克隆抗体。多克隆抗体的制备方法和酶标抗体的方法均为本领域常规操作。进一步地,所述定量检测试剂盒还包括CEA标准品、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液。上述抗CEA单克隆抗体、以及CEA标准品、辣根过氧化物酶标记抗CEA多克隆抗体、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液分别放入各个试剂瓶中,上述各试剂瓶由海绵托架固定,并同CEA抗体包被的酶标板和封板膜一同置于试剂盒盒体内。有益效果本专利技术的有益效果主要体现在：提供一种新的高亲和力的，可用于癌胚抗原检测的CEA抗体；由本专利技术抗体建立的CEA检测试剂盒操作简便易行,检测快速灵敏,所用酶标仪简单、普及,价格低廉，为结肠癌、直肠癌患者预后判断、疗效观察、监视肿瘤病灶的转移或复发的诊断提供了一种有效工具。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。图1小鼠单克隆抗体亚型鉴定图2抗CEA抗体特异性：不与MA、NCA等交叉反应图3本专利技术癌胚抗原检测试剂盒检测癌胚抗原CEA的标准曲线具体实施方式以下结合附图对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1.抗CEA抗体制备及纯化用DMEM培养基培养稳定表达CEA的CHO细胞，将107个CHO-CEA+细胞与弗氏完全佐剂一起注射到雌性Balb/c小鼠腹膜内，进行初次免疫，随后每2周再以107个CHO-CEA+细胞注射到上述雌性Balb/c小鼠腹膜内，继续免疫。最后在与骨髓瘤细胞融合前3天进行末次免疫，末次免疫以107个CHO-CEA+细胞静脉内免疫。取免疫后的Balb/c小鼠脾细胞，将其与骨髓瘤Sp2/0细胞株融合，将融合后的细胞用含有10％血清的Iscove培养基(0.1mM次黄嘌呤，0.4μM氨基蝶呤和16μM胸苷)稀释，稀释至适宜浓度后，加入96孔板内进行培养。10天后，取细胞上清，高通量ELISA法检测上清中与重组CEA蛋白表现出阳性反应的原代培养物。再将此孔内的杂交瘤细胞进行稀释进行亚克隆，同样以ELISA方法进行筛选，最终获得阳性杂交瘤细胞株。扩大培养后，冻存杂交瘤细胞。取BALB/c小鼠，在接种杂交瘤细胞前1周，经腹腔注射降植烷，0.5ml/只。1周后，每只小鼠经腹腔接种约1X106个杂交瘤细胞；7～10d后，收集腹水。将腹水经10000×g离心30min后，弃沉淀，用50％硫酸铵盐析粗提,PBS溶解，流水透析5h；用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)透析平衡过夜；上样，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)洗脱杂蛋白，用不同pH值的柠檬酸盐洗脱液洗脱，分段收集洗脱峰，浓缩后，经10％SDS-PAGE分析纯化单抗的纯度，间接ELISA法测定效价。经间接ELISA检测，8株mAb效价均可达1∶108。实施例2.抗CEA抗体亚型鉴定采用ELISA法鉴定实施例1得到的抗CEA单克隆抗体Cab-207的亚型(试剂盒购自Proteintech)。试剂盒中提供的酶标板上已经预包被了针对小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM、kappa轻链、lambda轻链的特异性抗体，将实施例1中纯化的抗CEA抗体样品Cab-207加入样品孔中，每孔50μl，无需孵育。将1X羊抗鼠IgA+IgM+IgG-HRP加入样品孔中，每孔50μl，轻轻混匀后，孵育1h。扣去孔中液体加入1XPBST洗孔3次，吸水纸吸干多余水分。加入显色液，每孔100μl，室温避光显色15min。加入100μl终止液，终止显色反应。通过酶标仪检测450nm处的OD值，结果如图1所示，我们得到的抗CEA单克隆抗体Cab-207的重链亚型均为IgG1，轻链均为Kappa。实施例3.单克隆抗体序列确定将Cab-207对应的杂交瘤细胞株复苏后，培养至总数量107个细胞，1000rpm离心5min收集细胞，提取RNA。向细胞沉淀中加入TRNzol-A+裂解，室温静止15min。每mlTRNzol-A+加入200μl氯仿，漩涡振荡15秒，放置3分钟。13000rpm4℃离心10分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CEA抗原定量检测试剂盒,其特征在于:包括抗CEA单克隆抗体包被的酶标板和抗CEA酶标抗体；所述抗CEA单克隆抗体包括重链可变区，其包含SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3,以及轻链可变区，其包含SEQ IDNO:4所示的CDR1、SEQ ID NO:5所示的CDR2和SEQ ID NO:6所示的CDR3。/n

【技术特征摘要】
1.一种CEA抗原定量检测试剂盒,其特征在于:包括抗CEA单克隆抗体包被的酶标板和抗CEA酶标抗体；所述抗CEA单克隆抗体包括重链可变区，其包含SEQIDNO:1所示的CDR1、SEQIDNO:2所示的CDR2和SEQIDNO:3所示的CDR3,以及轻链可变区，其包含SEQIDNO:4所示的CDR1、SEQIDNO:5所示的CDR2和SEQIDNO:6所示的CDR3。


2.一种CEA抗原定量检测试剂盒,其特征在于:包括抗CEA单克隆抗体包被的酶标板和抗CEA酶标抗体；所述抗CEA单克隆抗体包括重链可变区，其包含SEQIDNO:7所示的氨基酸序列,以及轻链可变区，其包含SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。


3.根据权利要求1或2所述的CEA抗原定量检测试剂盒,其特征在于:所述抗CEA酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的抗CEA多克隆抗体。


4.根据权利要求1至3中任何一项所述的CEA抗原...

【专利技术属性】
技术研发人员：王阳，金鑫，
申请(专利权)人：北京瀚梅生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11