草鱼黏液IgM重组表达蛋白、多克隆抗体制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种草鱼黏液IgM重组表达蛋白、多克隆抗体制备方法及其应用。本发明专利技术草鱼黏液IgM重组表达蛋白的制备方法，包括如下步骤：构建黏液IgM表达载体pET28a(+)‑IgM；将构建的重组质粒pET28a(+)‑IgM转入大肠杆菌菌株，使用IPTG诱导表达草鱼黏液IgM。本发明专利技术还涉及一种抗草鱼IgM多克隆抗体的制备方法和抗草鱼IgM多克隆抗体的应用。本发明专利技术为研究草鱼黏液IgM的结构、来源、功能提供了重要工具，为草鱼疾病的预防及治疗提供了重要的技术手段，为其他养殖鱼类疾病的防治提供参考。

【技术实现步骤摘要】
草鱼黏液IgM重组表达蛋白、多克隆抗体制备方法及其应用
本专利技术涉及一种多克隆抗体的制备方法及其应用，具体讲是一种抗草鱼(Paralichthysolivaceus)黏液IgM重组表达蛋白、多克隆抗体制备方法及其应用，属于鱼类分子免疫学

技术介绍
鱼类具有以免疫球蛋白(Ig)为中心的特异性免疫机制，在水环境中，其皮肤、鳃及其分泌的黏液等与外界环境直接接触，是鱼体抵抗外界病毒和细菌入侵的第一道防线，在免疫应答与免疫保护过程中起着极其重要的作用。鱼类黏液除含有非特异性免疫成分外，还含有免疫球蛋白。关于鱼类黏液免疫球蛋白与血清免疫球蛋白是否有着共同的起源，是否是一样的，目前还有很多争议。草鱼作为我国淡水养殖的四大家鱼之一，其养殖对我国农业经济增长具有重要的意义。目前，关于其免疫球蛋白的研究较多，已经报道了IgM、IgZ和IgD三种类型免疫球蛋白，及新型免疫球蛋白IgZ2、IgM-IgZ，其中，IgM、IgZ存在分泌型(即黏液IgM、IgZ)和膜结合型两种形式。本专利制备抗草鱼黏液IgM的多克隆抗体，可以为阐明IgM的结构、来源、功能以及与血清免疫球蛋白的关系等提供有力工具；另外，鱼类感染某种病原或接种疫苗后，鱼体会产生黏液IgM即分泌型IgM(SIgM)。因此，利用抗草鱼黏液IgM的多克隆抗体，通过检测草鱼黏液中IgM的产生，可以进行草鱼疾病的早期诊断和疫苗使用效果的评价，对草鱼疾病的预防及治疗具有重要理论和现实意义，对其他养殖鱼类疾病的防治具有参考价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种草鱼黏液IgM重组表达蛋白及抗草鱼黏液IgM多克隆抗体的制备方法；本专利技术的另一个目的是提供一种抗草鱼黏液IgM多克隆抗体的应用。本专利技术的目的是由以下技术方案实现的：一种草鱼黏液IgM重组表达蛋白及抗草鱼黏液IgM多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：构建黏液IgM表达载体pET28a(+)-IgM；将构建的重组质粒pET28a(+)-IgM转入大肠杆菌菌株，使用IPTG诱导表达草鱼黏液IgM。优化表达条件通过变复性的方式重溶目标蛋白，Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。以制备的草鱼黏液IgM蛋白作为抗原免疫新西兰白兔，经过3-4次免疫之后，经免疫学检测筛选方法，筛选出特异性分泌抗草鱼黏液IgM多克隆抗体。所述的构建黏液IgM表达载体，是设计全长拼接引物获得草鱼黏液IgM基因，经EcoRV及XhoI双酶切后连接pET28a(+)。所述的免疫学检测筛选方法是间接酶联免疫法和转印免疫印迹法；其中所述的间接酶联免疫法是将制备的免疫兔血清与纯化的草鱼黏液IgM蛋白于96孔酶标板中反应；继而加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体；450nm工作波长测定各孔光吸收值，筛选抗草鱼黏液IgM蛋白的多克隆抗体。所述的转印免疫印迹法是将制备的抗草鱼黏液IgM蛋白的多克隆抗体与转移至硝酸纤维素膜的草鱼黏液IgM蛋白反应，确定该多抗的抗原决定簇是分子量为62.50kDa的草鱼黏液IgM蛋白。一种所述抗草鱼黏液IgM多克隆抗体的应用，包括如下步骤：利用ELISA分析灭活柱状黄杆菌免疫草鱼后黏液IgM免疫应答规律；用免疫组织化学染色法定位草鱼黏液IgM在系统及黏膜组织中的分布。所述的ELISA是将收集免疫后的草鱼皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及胆汁包被至96孔板，多克隆抗体孵育；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；分析免疫后各分泌液中IgM蛋白水平变化。所述的免疫组织化学染色法是将多克隆抗体与草鱼黏膜组织石蜡切片反应；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；检测多克隆抗体可以特异性结合黏膜细胞膜表面的抗原决定簇。本专利技术的制备技术路线设计新颖，其通过构建重组质粒转入表达菌株，使用IPTG诱导表达草鱼黏液IgM，优化表达条件通过变复性的方式重溶目标蛋白，Ni柱亲和纯化获得高纯度的草鱼黏液IgM蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔；经筛选得到抗草鱼黏液IgM的多克隆抗体；所得的多克隆抗体再经间接酶联免疫法和转印免疫印迹法验证其特性。这样的制备技术路线严密合理且可行，充分发挥了现有免疫学检测筛选方法的作用和效果。抗草鱼黏液IgM的多克隆抗体能与草鱼黏液IgM特异性结合，且效价高。抗草鱼黏液IgM多克隆抗体的制得为研究草鱼黏液IgM的结构、来源、功能提供了重要工具，尤其是在疫苗效果评价使用中发挥重要作用。目前我国针对鱼类病原的灭活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗的研究已取得了丰硕成果，但应用尚处于初级阶段，绝大多数尚未实现真正意义的产业化应用，且疫苗效果缺乏简便、准确、有效的评价技术体系。传统疫苗效果评价一般采用攻毒实验测定保护率进行判定，存在引发疾病感染流行的隐患，结果受到病原特性、鱼体生理机能以及环境理化因素的影响，且对潜伏期长的病原容易造成误判。因此，亟需监测鱼体接种疫苗后体内细胞免疫应答和体液免疫应答的动态规律，分析和明确与疫苗免疫效果密切相关的关键免疫因子,并实现相关性的定量分析，从而构建鱼类疫苗效果评价体系。疫苗效果的评价主要包括检测鱼体内的免疫球蛋白和免疫细胞水平两个方面，利用制备的抗草鱼黏液IgM的多克隆抗体，通过ELISA、免疫渗滤、检测试纸、抗独特型抗体等测定鱼体抗致病性抗原(柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、呼肠孤病毒等)抗体IgM的含量，通过流式细胞术、免疫荧光技术测定鱼体免疫细胞的数量和免疫水平，从而进行疾病的早期诊断和疫苗使用效果的评价，为草鱼疾病的预防及治疗提供了重要的技术手段，为其他养殖鱼类疾病的防治提供参考。附图说明图1为构建的重组质粒pET28a(+)-IgM图谱。图2为IPTG诱导IgM重组表达及Ni柱亲和纯化IgM电泳图。图3为本专利技术的抗草鱼IgM多抗的转印免疫印迹检测结果图。图4为本专利技术的多克隆抗体ELISA法检测免疫刺激后草鱼IgM表达水平变化结果图。图5为本专利技术的抗草鱼IgM多抗的免疫组织化学的结果图。参见图1-图5：图1所示：构建的重组质粒pET28a(+)-IgM图谱。图2所示：M是标准分子量蛋白的考马斯亮蓝染色结果；1表示IPTG诱导空质粒；2表示IPTG未诱导重组质粒结果；3表示IPTG诱导重组质粒表达结果；4表示Ni柱亲和纯化结果，分子量为62.50kDa。图3所示：M是标准分子量蛋白；1表示抗IgM多抗孵育IPTG未诱导重组质粒结果；2表示抗IgM多抗孵育IPTG诱导重组质粒结果；3表示His单抗孵育IPTG诱导重组质粒结果分子量为62.50kDa。图4所示：A表示草鱼皮肤黏液IgM的ELISA结果；B表示草鱼鳃黏液IgM的ELISA结果；C表示草鱼肠黏液IgM的ELISA结果；D表示草鱼胆汁IgM的ELISA结果。小写字母：灭活柱状黄杆菌免疫刺激后各组不同时间蛋白表达水平显著性差异水平(P<0.05)。图5所示：A表示草鱼肠与兔抗草鱼IgM免疫组化结果；a表示草鱼肠与未免疫兔血清免疫组化结果；B表示草鱼皮肤与兔抗草鱼IgM多抗免疫组化结果；b表示草鱼皮肤与未免疫兔血清免疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种草鱼黏液IgM重组表达蛋白的制备方法，包括如下步骤：构建黏液IgM表达载体pET28a(+)-IgM；将构建的重组质粒pET28a(+)-IgM转入大肠杆菌菌株，使用IPTG诱导表达草鱼黏液IgM。/n

【技术特征摘要】
1.一种草鱼黏液IgM重组表达蛋白的制备方法，包括如下步骤：构建黏液IgM表达载体pET28a(+)-IgM；将构建的重组质粒pET28a(+)-IgM转入大肠杆菌菌株，使用IPTG诱导表达草鱼黏液IgM。


2.一种抗草鱼IgM多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：构建黏液IgM表达载体pET28a(+)-IgM；将构建的重组质粒pET28a(+)-IgM转入ArcticExpress菌株，使用IPTG诱导表达草鱼黏液IgM。


3.权利要求2所述的抗草鱼IgM多克隆抗体的制备方法，其特征在于：优化表达条件通过变复性的方式重溶目标蛋白，Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。


4.权利要求2所述的抗草鱼IgM多克隆抗体的制备方法，其特征在于：以制备的草鱼黏液IgM蛋白作为抗原免疫新西兰白兔，经过3-4次免疫之后，经免疫学检测筛选方法，筛选出特异性分泌抗草鱼黏液IgM多克隆抗体。


5.权利要求2所述的抗草鱼IgM多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的构建黏液IgM表达载体，是设计全长拼接引物获得草鱼黏液IgM基因，经EcoRV及XhoI双酶切后连接pET28a(+)。


6.权利要求4所述的抗草鱼IgM多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的免疫学检测筛选方法是间接酶联免疫法和转印免疫印迹...

【专利技术属性】
技术研发人员：许国晶，张金路，杜兴华，孟庆磊，王志忠，李壮，巩俊霞，成慧中，张明磊，
申请(专利权)人：山东省淡水渔业研究院山东省淡水渔业监测中心，
类型：发明
国别省市：山东;37