模块式肽基试剂制造技术

本发明专利技术提供可以向其中引入一个或若干个相互作用的结构域的稳定肽骨架。这样的相互作用的结构域可以是特异结合结构域、抑制剂结构域、接头、标记、固相支持物、反应位点、催化位点、有用的化学实体、及试剂。相互作用的结构域向肽骨架的附着或整合产生肽基试剂。本发明专利技术还提供产生可用作相互作用的结构域的肽文库的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及具有稳定骨架的肽，该稳定骨架易于修饰以提供多个相互作用的结构域例如抑制或结合结构域。
技术介绍
基于免疫学的诊断分析的一个缺点是其依赖于抗体的使用。这些试剂，无论单克隆或多克隆，都是大型大分子多肽，它们制备昂贵且因常在保存期间变得不稳定而使许多诊断产品的保存期很短。此外，一个典型的免疫球蛋白(例如IgG)含有大量在生理学上重要但在抗原识别中却不起作用的物质(Fc区域)。这样的附加物质对许多应用都是非必需的，并会增加背景噪音、抑制扩散以及引起副反应。此外，将抗体重链和轻链结合在一起的二硫键是潜在不稳定的。这样，抗体结构(和物质)的只有一小部分是直接涉及抗原识别的，然而抗原整体却常常被制备并用于传感器或诊断装置中。从完整抗体生产较小的Fab区域是可能的，但是Fab生产需要若干化学或酶加工步骤以及额外的蛋白纯化程序。这些加工程序会增加诊断产品的成本。所需要的是易于合成、稳定的抗原识别元素，其涉及抗原识别的分子质量比例更高。专利技术概述本专利技术提供易于合成的、易于修饰以包括结合结构域、抑制剂结构域、接头、标记、试剂、反应位点、催化位点的肽骨架，或试剂以及其它化学实体。在一种实施方式中，本专利技术提供包含与SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的稳定分离肽。这样的稳定分离肽可以具有聚脯氨酸螺旋、短环区以及α螺旋，其中肽发生折叠以使聚脯氨酸螺旋与α螺旋产生疏水相互作用。本专利技术的肽是衍生自鸟胰多肽的小肽，它常比具SEQ ID NO1的肽更稳定。本专利技术的其它肽不如具SEQ ID NO1的肽稳定。理想的肽包括与SEQ IDNO11或14具有至少90％同一性的氨基酸序列。具有SEQ ID NO11或14的肽如上所述发生折叠，并经二硫键进一步稳定。本专利技术还提供分离的编码稳定肽的核酸，该稳定肽包含与SEQ IDNO2～6、8～11或14之中任一序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。优选地，该分离的核酸编码与SEQ ID NO11或14中任一具有至少90％同一性的氨基酸序列。这样的核酸例子包括SEQ ID NO12或13。在另一实施方式中，本专利技术提供包含肽骨架和相互作用的结构域的肽基试剂，其中肽骨架包含与SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。理想的肽基试剂具有肽骨架和相互作用的结构域，其中肽骨架包含与SEQ ID NO11或14具有至少90％同一性的氨基酸序列。该肽骨架可以具有聚脯氨酸螺旋、短环区和α螺旋，其中肽骨架发生折叠以使聚脯氨酸螺旋与α螺旋产生疏水相互作用。理想的肽骨架比具有SEQ ID NO1的肽更稳定。理想的肽基试剂比不具有相互作用的结构域的肽骨架更稳定。然而，某些相互作用的结构域的插入会使得肽骨架不稳定，对本领域技术人员来说这些去稳定化的肽基试剂仍然是有用的。用于附着在，或插入，肽骨架的相互作用的结构域可以是由本领域技术人员选择的任何有用的肽或分子。相互作用的结构域的例子包括结合结构域、抑制剂结构域、抗原识别肽、接头、标记、固相支持物、和酶活性位点。本专利技术的一种肽基试剂具有相互作用的结构域，此处该肽包含SEQ ID NO18。本专利技术还提供一种方法，包括定义含有靶蛋白上的相互作用位点的搜索范围，该肽可与靶蛋白相互作用；为该肽定义大小；为该肽的氨基酸序列中各位置定义氨基酸类别；用已定义的氨基酸类别中的各成员取代该肽序列氨基酸序列的各位置以生成包括输出肽序列集合(plurality)的输出文库文档；将输出文库文档传输给分子对接程序以使各输出肽序列集合成员与搜索范围拟合并产生靶蛋白质-肽序列拟合得分(fit score)；根据靶蛋白质-肽序列拟合得分将输出肽序列集合分级；以及展示各输出肽序列集合成员及其关联靶蛋白质-肽序列拟合得分；其中一部分输出肽序列集合能够与靶蛋白质稳定相互作用。搜索范围可以包括靶蛋白质中各非氢原子的x-、y-、和z-坐标。具有较高靶蛋白质-肽序列拟合得分的输出肽序列常能以较高的亲和力与靶蛋白质结合。该方法可进一步包括接受输入百分数选择以将输出肽序列集合限制在一个确定的百分数；其中输入百分数选择可以限制输出文库文档的大小和文库的复杂性。各氨基酸类别可各自包括任一遗传编码的L-氨基酸、天然存在的非遗传编码L-氨基酸、合成的L-氨基酸、遗传编码氨基酸的D-对映异构体、天然存在的非遗传编码氨基酸的D-对映异构体、或合成的D-氨基酸。各氨基酸类别也可各自包括任一亲水氨基酸、疏水氨基酸、类半胱氨酸氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、极性氨基酸、芳香族氨基酸、非极性氨基酸或脂肪族氨基酸。在一种实施方式中，靶蛋白质为牛胰蛋白酶且输出肽序列之一为YKLKY(SEQ ID NO18)。本专利技术还指向产生肽序列的系统，包括处理器；与处理器相连的存储器；与处理器相连的显示器；能够在处理器上执行以产生肽序列的肽序列制备组件；能够在处理器上执行以显示肽序列制备组件所用的各氨基酸残基的类别输出组件；和能够在处理器上执行以展示肽序列的肽序列输出组件。一个显示器的例子是打印机。输出类别组件能显示肽序列制备组件所用的各氨基酸残基类别。本专利技术进一步提供带有与能指导机器完成某方法相关内容的机读介质，该方法包括接收包含靶位上原子坐标集合的搜索范围，肽集合能以不同的亲和力与该靶位结合；接收包括很多氨基酸的肽长度参数；接收定义的、用于沿肽长各位置拟合分析的氨基酸结构类别；生成含有输出肽序列集合的输出文库文档，该输出肽序列集合包括定义的、沿肽长各位置的氨基酸结构类别的每个氨基酸；继而翻译和旋转与搜索范围相关的肽内各位置上的氨基酸结构类别中的各成员，以随之产生带有靶位-肽序列拟合得分的肽序列；根据靶位-肽序列拟合得分将肽序列分级；以及显示具有相关肽序列的所选择的靶位-肽序列拟合得分百分比；由机读介质完成的该方法可进一步包括显示输出肽序列标记和储存搜索范围。 附图说明附图1提供SAP肽的DNA和氨基酸序列。星号表示终止密码子。密码子选择偏好E.coli。如果SAP分子由重组方法产生则使用起始甲硫氨酸。如果肽分子由化学方法产生，则可省略甲硫氨酸残基。附图2提供最终的SAP DNA序列。为便于克隆，为附图1所示DNA序列添加了侧翼核苷酸。5′Nde I位点以下划线表示，3′Bam HI和内部Sma I位点以相同方式表示。附图3提供SAP肽的带状图。链从左侧的末端甲硫氨酸开始，且序列延伸进入聚脯氨酸螺旋、短环结构域，并最终进入右侧的α螺旋区。肽以末端半胱氨酸为终点。附图4提供与附图3相同视角的SAP肽分子结构，但是显示了氨基酸侧链。附图5突出显示SAP分子中三个半胱氨酸残基的位置。可以形成二硫键使SAP肽几乎环化。末端半胱氨酸对将肽锚定在诊断装置中的固体基质上有用。附图6提供SAP和牛胰蛋白酶间相互作用的ITC分析。SAP溶于20mM二甲基胂酸盐(pH 7.0)、20mM NaCl，终浓度为2mM。将胰蛋白酶透析至相同的缓冲液中，并以20μM的浓度用于量热计中。整个滴定过程中无明显结合。温度保持在30℃。采用每5μL注射40次，两次注射间重新平衡240秒。附图7提供SAP-1和牛胰蛋白酶间相互作用的ITC分析。SAP-1溶于20mM二甲基胂酸盐(pH本文档来自技高网...

【技术保护点】
稳定的分离肽，其含有与ＳＥＱＩＤＮＯ：２～６、８～１１或１４之中任一具有至少９０％同一性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
US 2001-12-20 10/027,0381.稳定的分离肽，其含有与SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一具有至少90％同一性的氨基酸序列。2.稳定的分离肽，其含有SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一序列。3.权利要求1或2的稳定分离肽，其中肽具有聚脯氨酸螺旋、短环区以及α螺旋，且其中肽发生折叠以使聚脯氨酸螺旋与α螺旋产生疏水相互作用。4.权利要求1或2的稳定分离肽，其中肽比具有SEQ ID NO1的肽更稳定。5.权利要求1或2的稳定分离肽，其中肽含有与SEQ ID NO11或14具有至少90％同一性的氨基酸序列。6.稳定的分离肽，其含有SEQ ID NO11或14。7.权利要求6的稳定分离肽，其中肽具有聚脯氨酸螺旋、短环区以及α螺旋，且其中肽发生折叠以使聚脯氨酸螺旋与α螺旋产生疏水相互作用。8.权利要求6的稳定分离肽，其中肽发生折叠并经二硫键进一步稳定。9.权利要求6的稳定分离肽，其中肽比具有SEQ ID NO1的肽更稳定。10.分离的核酸，其编码含有与SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一具有至少90％同一性的氨基酸序列的稳定肽。11.权利要求10的分离的核酸，其中肽含有与SEQ ID NO11或14具有至少90％同一性的氨基酸序列。12.分离的核酸，其编码含有氨基酸序列SEQ ID NO11或14的稳定肽。13.权利要求12的核酸，其中核酸含有SEQ ID NO12或13。14.含有肽骨架和相互作用的结构域的肽基试剂，其中肽骨架含有与SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一具有至少90％同一性的氨基酸序列。15.含有肽骨架和相互作用的结构域的肽基试剂，其中肽骨架含有SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一序列。16.权利要求14或15的肽基试剂，其中肽骨架具有聚脯氨酸螺旋、短环区和α螺旋，且其中肽骨架发生折叠以使聚脯氨酸螺旋与α螺旋产生疏水相互作用。17.权利要求14或15的肽基试剂，其中肽骨架比具有SEQ IDNO1的肽更稳定。18.权利要求14或15的肽基试剂，其中肽基试剂比不具有相互作用的结构域的肽骨架更稳定。19.权利要求14或15的肽基试剂，其中相互作用的结构域是结合结构域、抑制剂结构域、抗原识别肽、接头、标记、固相支持物或酶活性位点。20.权利要求14或15的肽基试剂，其中相互作用的结构域是含有SEQ ID NO18的肽。21.权利要求14或15的肽基试剂，其中肽骨架含有与SEQ IDNO11或14具有至少90％同一性的氨基酸序列。22.含有肽骨架和相互作用的结构域的肽基试剂，其中肽骨架含有SEQ ID NO11或14。23.权利要求22的肽基试剂，其中肽骨架具有聚脯氨酸螺旋、短环区和α螺旋，且其中肽骨架发生折叠以使聚脯氨酸螺旋与α螺旋产生疏水相互作用。24.权利要求22的肽基试剂，其中肽骨架发生折叠并经二硫键进一步稳定。25.权利要求22的肽基试剂，其中肽骨架比具有SEQ ID NO1的肽更稳定。26.权利要求22的肽基试剂，其中肽基试剂比不具有相互作用的结构域的肽骨架更稳定。27.权利要求22的肽基试剂，其中相互作用的结构域是结合结构域、抑...

【专利技术属性】
技术研发人员：S奎尔克，
申请(专利权)人：金伯利克拉克环球有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]