用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法，基于荧光共振能量转移或报告基因片段互补，通过质粒共转染细胞后，培养基中加入不同浓度的P4HA1抑制剂s4682，加药24h后酶标仪检测FRET，或荧光数据或化学发光，FRET、Venus片段互补和Gluc片段互补测试测得s4682抑制胶原链分子间相互作用的IC50，以上结果证实了该筛选方法的实用性。还公开了一种利用该方法在测定降低胶原三股螺旋稳定性药物的药效定量分析中的应用以及在测定增加胶原三股螺旋稳定性化合物的定量分析中的应用。

【技术实现步骤摘要】
用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法
本专利技术涉及生物医药领域，特别是涉及一种用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法。
技术介绍
任何原因引起的组织细胞损伤，均可导致组织细胞发生变性、坏死和炎症反应。如果损伤很小，损伤细胞周边正常实质细胞将发生增生修复，这种修复可完全恢复正常的结构和功能。然而如果损伤较大或反复损伤超出了损伤周围实质细胞的再生能力时，细胞外基质将大量增生对缺损组织进行修复，即发生纤维化的病理改变。因此本质上纤维化是组织遭受损伤后的修复反应，以保护组织器官的相对完整性。增生的纤维结缔组织虽然修复了缺损，但却不具备原来器官实质细胞的结构和功能。如果这种修复反应过度、过强和失控时，就会引起器官的纤维化和导致器官的功能下降。在全世界范围内，组织纤维化是许多疾病致残、致死的主要原因，据有关统计资料证明，因各种疾病而致死的病人中，接近45％可以归于组织纤维增生疾病，例如肝纤维化所致肝衰竭或肝癌、肺纤维化所致呼吸衰竭，肾纤维化所致肾功能衰竭和尿毒症等等，都是致死性高的并发症。器官损伤后，一些可以产生胶原的细胞在因子刺激下向成纤维细胞类型转化，并合成大量胶原，例如肝内的星状细胞、肝窦内皮细胞等，肺内的原始间叶细胞、肺泡II型上皮细胞、动脉血管内皮及平滑肌细胞等，肾内系膜细胞、肾间质成纤维细胞等细胞被活化并产生胶原纤维、可造成纤维化。此类胶原纤维的类型主要是I、III和IV型。所以I型和III型胶原分子的合成步骤可作为抗器官纤维化药物的靶点。人们发现器官纤维化发生过程总是有一些细胞因子参与，例如转化生长因子TGF-β、血小板生长因子PDGF、结缔组织生长因子CTGF、γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子TNF-α等等，其中TGF-β、PDGF和CTGF是实验室及临床常用的器官纤维化检测指标，也是实验室中用来激活成纤维样细胞合成胶原的常用因子。细胞因子可以增加胶原脯氨酸羟化酶和赖氨酸羟化酶的转录，这两类酶催化了胶原肽链中脯氨酸/赖氨酸的羟基化，使I型胶原的(α1)2α2三股螺旋和III型胶原(α1)3三股螺旋稳定性增加。基于以上机制，需要开发一种用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法，用荧光共振能量转移(FRET)或报告基因(Venus荧光蛋白或Gaussia荧光素酶)片段互补方法检测胶原肽分子间相互作用情况反映了三股螺旋的稳定性。为解决上述技术问题，本专利技术采用的第一个技术方案是：提供一种用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法，包括以下步骤：步骤1：构建去掉信号肽的人I型胶原α1与mVenus融合表达质粒mVenus-Col1A1、去掉信号肽的人I型胶原α2与mApple融合表达质粒mApple-Col1A2，去掉信号肽的人III型胶原α1与mVenus融合表达质粒mVenus-Col3A1和去掉信号肽的人III型胶原α1与mApple融合表达质粒mApple-Col3A1，经转化DH5α菌和质粒提取步骤得到用于转染的质粒；步骤2：利用成纤维细胞共转染mVenus-Col1A1和mApple-Col1A2，或mVenus-Col3A1和mApple-Col3A1，质粒共转染细胞后12h，加入浓度为0.01—500μM的P4HA1抑制剂s4682；步骤3：用药干预24—48h后酶标仪检测FRET，根据测得的能量转移效率得到抑制剂s4682抑制胶原链分子间相互作用的IC50。在本专利技术一个较佳实施例中，在步骤3中，检测FRET的具体步骤为500—515nm激发，检测525—545nm和580—620nm荧光强度FI530和FI590。为解决上述技术问题，本专利技术采用的第二个技术方案是：提供一种用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法，包括以下步骤：步骤1：构建去掉信号肽的人I型胶原α1与mVenus-N端(2-173aa)片段的融合表达质粒VN-Col1A1，去掉信号肽的人I型胶原α2与mVenus-C端(156-239aa)片段的融合表达质粒VC-Col1A2；去掉信号肽的人III型胶原α1与mVenus-N端片段融合表达质粒mVN-Col3A1和去掉信号肽的人III型胶原α1与mVenus-C端片段融合表达质粒mVC-Col3A1，经转化DH5α菌和质粒提取步骤得到用于转染的质粒；步骤2：利用成纤维细胞共转染VN-Col1A1和VC-Col1A2，或VN-Col3A1和VC-Col3A1，质粒共转染细胞后12h，加入浓度为0.01—500μM的P4HA1抑制剂s4682；步骤3：用药干预24—48h后酶标仪检测Venus荧光，根据测得的Venus相对荧光强度得到抑制剂s4682抑制胶原链分子间相互作用的IC50。在本专利技术一个较佳实施例中，在步骤3中，检测Venus荧光采用的激发波长为510—520nm，发射波长为528—560nm。为解决上述技术问题，本专利技术采用的第三个技术方案是：提供一种用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法，包括以下步骤：步骤1：构建去掉信号肽的人I型胶原α1与Gluc-N端(2～416aa)片段的融合表达质粒GlucN-Col1A1，去掉信号肽的人I型胶原α2与Gluc-C端(398～550aa)片段的融合表达质粒GlucC-Col1A2；去掉信号肽的人III型胶原α1与Gluc-N端片段融合表达质粒GlucN-Col3A1和去掉信号肽的人III型胶原α1与Gluc-C端片段融合表达质粒GlucC-Col3A1，经转化DH5α菌和质粒提取步骤得到用于转染的质粒；步骤2：利用成纤维细胞共转染GlucN-Col1A1和GlucC-Col1A2，或GlucN-Col3A1和GlucC-Col3A1，质粒共转染细胞后12h，加入浓度为0.01—500μM的P4HA1抑制剂s4682；步骤3：用药干预24—48h后加入荧光素酶底物，用酶标仪检测Gluc化学发光，根据测得的相对化学发光强度得到抑制剂s4682抑制胶原链分子间相互作用的IC50。为解决上述技术问题，本专利技术采用的第四个技术方案是：提供一种利用上述方法在测定降低胶原三股螺旋稳定性药物的药效定量分析中的应用。在本专利技术一个较佳实施例中，所述降低胶原三股螺旋稳定性的药物用于治疗胶原增生疾病，包括器官纤维化、瘢痕。为解决上述技术问题，本专利技术采用的第五个技术方案是：提供一种利用上述方法在测定增加胶原三股螺旋稳定性化合物的定量分析中的应用。在本专利技术一个较佳实施例中，所述增加胶原三股螺旋稳定性的化合物包括用于治疗胶原产生过少导致的疾病和症状的药物、化妆品，所述药物治疗的疾病和症状包括成骨不全、视网膜剥离、皮肤松弛。本专利技术的有益效果是：本专利技术影响胶原稳定性化合物的筛选基于荧光共振能量转移(FRET)，或报告基因片段互补，测得脯氨酸羟化酶抑制剂s4682抑制胶原链分子间相互本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1：构建去掉信号肽的人I型胶原α1与mVenus融合表达质粒mVenus-Col1A1、去掉信号肽的人I型胶原α2与mApple融合表达质粒mApple-Col1A2，去掉信号肽的人III型胶原α1与mVenus融合表达质粒mVenus-Col3A1和去掉信号肽的人III型胶原α1与mApple融合表达质粒mApple-Col3A1，经转化DH5α菌和质粒提取步骤得到用于转染的质粒；/n步骤2：利用成纤维细胞共转染mVenus-Col1A1和mApple-Col1A2，或mVenus-Col3A1和mApple-Col3A1，质粒共转染细胞后12h，加入浓度为0.01—500μM的P4HA1抑制剂s4682；/n步骤3：用药干预24—48h后酶标仪检测FRET，根据测得的能量转移效率得到抑制剂s4682抑制胶原链分子间相互作用的IC50。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：构建去掉信号肽的人I型胶原α1与mVenus融合表达质粒mVenus-Col1A1、去掉信号肽的人I型胶原α2与mApple融合表达质粒mApple-Col1A2，去掉信号肽的人III型胶原α1与mVenus融合表达质粒mVenus-Col3A1和去掉信号肽的人III型胶原α1与mApple融合表达质粒mApple-Col3A1，经转化DH5α菌和质粒提取步骤得到用于转染的质粒；
步骤2：利用成纤维细胞共转染mVenus-Col1A1和mApple-Col1A2，或mVenus-Col3A1和mApple-Col3A1，质粒共转染细胞后12h，加入浓度为0.01—500μM的P4HA1抑制剂s4682；
步骤3：用药干预24—48h后酶标仪检测FRET，根据测得的能量转移效率得到抑制剂s4682抑制胶原链分子间相互作用的IC50。


2.根据权利要求1所述的用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法，其特征在于，在步骤3中，检测FRET的具体步骤为500—515nm激发，检测525—545nm和580—620nm荧光强度FI530和FI590。


3.一种用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：构建去掉信号肽的人I型胶原α1与mVenus-N端(2-173aa)片段的融合表达质粒VN-Col1A1，去掉信号肽的人I型胶原α2与mVenus-C端(156-239aa)片段的融合表达质粒VC-Col1A2；去掉信号肽的人III型胶原α1与mVenus-N端片段融合表达质粒mVN-Col3A1和去掉信号肽的人III型胶原α1与mVenus-C端片段融合表达质粒mVC-Col3A1，经转化DH5α菌和质粒提取步骤得到用于转染的质粒；
步骤2：利用成纤维细胞共转染VN-Col1A1和VC-Col1A2，或VN-Col3A1和VC-Col3A1，质粒共转染细胞后12h，加入浓度为0.01—500μM的P4HA1抑制剂s4682；
步骤3：用药干预24—48h后酶标仪检测Venus荧光，根据测...

【专利技术属性】
技术研发人员：王阳，柏旭，
申请(专利权)人：厦门市博瑞来医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35