一种测定配方乳粉中酪蛋白含量的双曲线法组成比例

一种测定配方乳粉中酪蛋白含量的双曲线法。现有技术用光密度计对按分子量顺序分离开的酪蛋白与乳清蛋自各谱带进行测定，求得酪蛋白与乳清蛋白的含量比率，测定结果准确性和精密度差。本发明专利技术其方法包括如下步骤：将被测样品经6mol/L盐酸于110℃水解22小时，水解溶液定容50mL后过滤，样品滤液和标准品溶液同时用衍生剂衍生，衍生物经高效液相色谱仪或超高效液相色谱仪分离、紫外检测器检测，测定出缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸的含量，样品中酪蛋白含量与其所含的两种氨基酸含量比值存在二次函数的曲线关系，用不同含量的酪蛋白值与其所含的缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸中两种氨基酸比值制作两个定量曲线方程。本发明专利技术用于测定婴儿配方乳粉中酪蛋白含量的双曲线法。

【技术实现步骤摘要】
一种测定配方乳粉中酪蛋白含量的双曲线法
本专利技术涉及婴儿乳粉配方
，具体涉及一种测定配方乳粉中酪蛋白含量的双曲线法。
技术介绍
目前使用GB/T5413.2-1997《婴幼儿配方食品和乳粉乳清蛋白的测定》，测定婴儿配方粉中酪蛋白/乳清蛋白的比例,试样用SDS-聚苯烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE,Laemmli法)后，现有技术用光密度计对按分子量顺序分离开的酪蛋白与乳清蛋白各谱带进行测定，求得酪蛋白与乳清蛋白的含量比率，该项技术可操作性差，测定结果准确性和精密度差。本申请填补了婴儿配方乳粉酪蛋白和乳清蛋白测定的技术缺陷，可操作性强、大大提高了方法的准确性和精密度。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种测定配方乳粉中酪蛋白含量的双曲线法，该方法是配制一组定量样品，选择三种氨基酸，同时制作两条定量曲线，能够达到测定效率高，事半功倍的功效。上述的目的通过以下的技术方案实现：一种测定配方乳粉中酪蛋白含量的双曲线法，该方法包括如下步骤：首先是将被测样品经6mol/L盐酸于110℃水解22小时，水解溶液定容50mL后过滤，样品滤液和标准品溶液同时用衍生剂衍生，衍生物经高效液相色谱仪或超高效液相色谱仪分离、紫外检测器检测，测定出缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸的含量，样品中酪蛋白含量与其所含的两种氨基酸含量比值存在二次函数的曲线关系，用不同含量的酪蛋白值与其所含的缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸中两种氨基酸比值制作两个定量曲线方程，将被测样品中测得的相应氨基酸比值分别带入相应的曲线方程，计算出两个酪蛋白含量值，取平均值为测定结果；（1）试样的制备A、氨基酸试样制备：称取适量样品，其中蛋白质含量为10.0～30.0mg，置于带密封垫螺纹盖水解管中，向水解管内加45℃～50℃的温水6mL，轻轻震荡溶解样品，再加入浓盐酸6mL，轻震混匀，充入氮气1min后，拧紧螺丝盖，将水解管放在110℃±1℃的恒温干燥箱内水解22h后取出冷却至室温；将水解液用超纯水转移并定容至50mL容量瓶中，残液洗三次，洗液合并后定容，混匀，滤纸过滤，吸取滤液1mL放入指型瓶中，在60℃±2℃氮吹仪上浓缩至干或在低于50℃下减压蒸馏至干，残留物用1mL超纯水溶解，即为试样溶液；B、游离氨基酸试样制备：准确称取混合均匀的样品约2.5g，精确至0.0001g放入100mL锥形瓶中，加入约25mL45℃~50℃温水溶解，降至室温后用盐酸溶液调节样品溶液的pH值至1.7±0.1，放置约1min，再用氢氧化钠溶液调节样品溶液的pH值至4.5±0.1，超声振荡约10min，用水转移并定容至50mL容量瓶中混匀，滤纸过滤后经0.22μm滤膜过滤，滤液即为试样溶液；（2）曲线的制作A、氨基酸标准曲线制作：将标准工作液衍生液注入到超高效液相色谱仪或高校液相色谱仪中，得到氨基酸标准工作液的峰面积，以标准工作液的峰面积为纵坐标，以标准工作液浓度μmol/mL为横坐标绘制标准曲线，该曲线用于计算各氨基酸浓度和含量，其中含量以每100克蛋白质中氨基酸所含克数表示。、样品定量计算的双曲线制作：以配制的不同酪蛋白含量为纵坐标，以上机测定后得到的缬氨酸/丙氨酸、缬氨酸/脯氨酸或其比值的倒数为横坐标，分别制定两个定量计算曲线，即双曲线，得到两个曲线方程，要求相关系数平方值≥0.9980；（3）样品溶液的测定将样品待测液注入到超高效液相色谱仪或高效液相色谱仪中得到峰面积，根据氨基酸标准曲线得到样品待测液中所需氨基酸的浓度μmol/mL，并可计算其含量及所需氨基酸比值；（4）总蛋白的测定样品中总蛋白的测定，在催化加热条件下使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，碱化蒸馏时氨游离被硼酸吸收，用硫酸或盐酸滴定，根据酸的消耗体积乘以换算系数计算，即为蛋白质含量；（5）氨基酸的计算样品中各氨基酸占乳蛋白的含量按下列公式计算：其中：X——样品中氨基酸的含量，单位为克每百克蛋白质；X1——样品中总氨基酸的含量，单位为克每百克蛋白质；X2——样品中游离氨基酸的含量，单位为克每百克蛋白质；C1——从标准曲线中获得试样总氨基酸测定液的浓度,单位为微摩每毫升μmol/mL；C2——从标准曲线中获得游离氨基酸测定液的浓度，单位为微摩每毫升μmol/mL；m1——称取的测定水解氨基酸样品的质量，单位为克；m2——称取的测定游离氨基酸的样品的质量，单位为克；MAA——各氨基酸的摩尔质量，单位为克每摩尔g/mol；V1——测定水解氨基酸样品的体积，单位为毫升；V2——测定游离氨基酸样品的体积，单位为毫升；n1——测定水解氨基酸样品的稀释倍数；n2——测定游离氨基酸样品的稀释倍数；P——乳清蛋白含量，单位为克每百克；Pz——总蛋白含量，单位为克每百克；PF——乳酪蛋白含量，单位为克每百克；（6）酪蛋白含量计算由实验得到被测样品的相应的氨基酸含量比值分别代入各自双曲线方程，得到两个酪蛋白含量，取平均值为测定结果，保留至小数点后一位，如需要计算乳清蛋白，则用100减去酪蛋白含量即得到乳清蛋白含量；（7）精密度双曲线测得的两个酪蛋白含量的绝对差值不得超过其算术平均值的5%。有益效果：1.本专利技术是一种测定配方乳粉中酪蛋白含量的双曲线法，具体采用双曲线方法计算被测样品中酪蛋白含量，配制一组定量样品，选择三种氨基酸，同时制作两条定量曲线，（双曲线）测定效率高，能够达到事半功倍的效果。本专利技术填补了婴儿配方乳粉酪蛋白和乳清蛋白测定的技术缺陷，可操作性强、大大提高了方法的准确性和精密度。本专利技术每组曲线的横坐标都由不同的氨基酸比值构成，相当于天然内标，优于后添加的内标物，测得的两种氨基酸的基质背景完全一致，从而消除基质干扰，解决了其它传统方法中后加的内标物游离在样品中，与被测组分基质不完全一致，造成测定配方乳粉中酪蛋白含量不准确的弊病。本专利技术采用双曲线法对同一个样品经过一次处理同时得到两个曲线获得两个测定数据，干扰因素互相抵消，测定数据精密度明显提高。本专利技术的方法采用的天然内标物，消除较多的测定误差，有效提高了测定结果的准确性。附图说明：附图1是本专利技术的氨基酸超高效液相色谱图。附图2是本专利技术的氨基酸高效液相色谱图。附图3是本专利技术的酪蛋白定量测定双曲线示意图之一。附图4是本专利技术的酪蛋白定量测定双曲线示意图之二。具体实施方式：实施例1：一种测定配方乳粉中酪蛋白含量的双曲线法，该方法包括如下步骤：首先是将被测样品经6mol/L盐酸于110℃水解22小时，水解溶液定容50mL后过滤，样品滤液和标准品溶液同时用衍生剂衍生，衍生物经高效液相色谱仪或超高效液相色谱仪分离、紫外检测器检测，测定出缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸的含量，样品中酪蛋白含量与其所含的两种氨基酸含量比值存在二次函数的曲线关系，用不同含量的酪本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定配方乳粉中酪蛋白含量的双曲线法，其特征是：该方法包括如下步骤：首先是将被测样品经6mol/L盐酸于110℃水解22小时，水解溶液定容50mL后过滤，样品滤液和标准品溶液同时用衍生剂衍生，衍生物经高效液相色谱仪或超高效液相色谱仪分离、紫外检测器检测，测定出缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸的含量，样品中酪蛋白含量与其所含的两种氨基酸含量比值存在二次函数的曲线关系，用不同含量的酪蛋白值与其所含的缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸中两种氨基酸比值制作两个定量曲线方程，将被测样品中测得的相应氨基酸比值分别带入相应的曲线方程，计算出两个酪蛋白含量值，取平均值为测定结果；/n（1）试样的制备/nA、氨基酸试样制备：称取适量样品，其中蛋白质含量为10.0～30.0mg，置于带密封垫螺纹盖水解管中，向水解管内加45℃～50℃的温水6mL，轻轻震荡溶解样品，再加入浓盐酸6mL，轻震混匀，充入氮气1min后，拧紧螺丝盖，将水解管放在110℃±1℃的恒温干燥箱内水解22 h后取出冷却至室温；/n将水解液用超纯水转移并定容至50 mL容量瓶中，残液洗三次，洗液合并后定容，混匀，滤纸过滤，吸取滤液1 mL放入指型瓶中，在60 ℃±2 ℃氮吹仪上浓缩至干或在低于50 ℃下减压蒸馏至干，残留物用1 mL超纯水溶解，即为试样溶液；/nB、游离氨基酸试样制备：准确称取混合均匀的样品约2.5 g，精确至0.0001 g放入100mL锥形瓶中，加入约25 mL45 ℃～50 ℃温水溶解，降至室温后用盐酸溶液调节样品溶液的pH值至1.7±0.1，放置约1 min，再用氢氧化钠溶液调节样品溶液的pH值至4.5±0.1，超声振荡约10 min，用水转移并定容至50 mL容量瓶中混匀，滤纸过滤后经0.22 μm滤膜过滤，滤液即为试样溶液；/n（2）曲线的制作/nA、氨基酸标准曲线制作：将标准工作液衍生液注入到超高效液相色谱仪或高校液相色谱仪中，得到氨基酸标准工作液的峰面积，以标准工作液的峰面积为纵坐标，以标准工作液浓度μmol/mL为横坐标绘制标准曲线，该曲线用于计算各氨基酸浓度和含量，其中含量以每100克蛋白质中氨基酸所含克数表示；/nB、样品定量计算的双曲线制作：以配制的不同酪蛋白含量为纵坐标，以上机测定后得到的缬氨酸/丙氨酸、缬氨酸/脯氨酸或其比值的倒数为横坐标，分别制定两个定量计算曲线，即双曲线，得到两个曲线方程，要求相关系数平方值≥0.9980；/n（3）样品溶液的测定/n将样品待测液注入到超高效液相色谱仪或高效液相色谱仪中得到峰面积，根据氨基酸标准曲线得到样品待测液中所需氨基酸的浓度μmol/mL，并可计算其含量及所需氨基酸比值；/n（4）总蛋白的测定/n样品中总蛋白的测定，在催化加热条件下使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，碱化蒸馏时氨游离被硼酸吸收，用硫酸或盐酸滴定，根据酸的消耗体积乘以换算系数计算，即为蛋白质含量；/n（5）氨基酸的计算/n样品中各氨基酸占乳蛋白的含量按下列公式计算：/n...

【技术特征摘要】
1.一种测定配方乳粉中酪蛋白含量的双曲线法，其特征是：该方法包括如下步骤：首先是将被测样品经6mol/L盐酸于110℃水解22小时，水解溶液定容50mL后过滤，样品滤液和标准品溶液同时用衍生剂衍生，衍生物经高效液相色谱仪或超高效液相色谱仪分离、紫外检测器检测，测定出缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸的含量，样品中酪蛋白含量与其所含的两种氨基酸含量比值存在二次函数的曲线关系，用不同含量的酪蛋白值与其所含的缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸中两种氨基酸比值制作两个定量曲线方程，将被测样品中测得的相应氨基酸比值分别带入相应的曲线方程，计算出两个酪蛋白含量值，取平均值为测定结果；
（1）试样的制备
A、氨基酸试样制备：称取适量样品，其中蛋白质含量为10.0～30.0mg，置于带密封垫螺纹盖水解管中，向水解管内加45℃～50℃的温水6mL，轻轻震荡溶解样品，再加入浓盐酸6mL，轻震混匀，充入氮气1min后，拧紧螺丝盖，将水解管放在110℃±1℃的恒温干燥箱内水解22h后取出冷却至室温；
将水解液用超纯水转移并定容至50mL容量瓶中，残液洗三次，洗液合并后定容，混匀，滤纸过滤，吸取滤液1mL放入指型瓶中，在60℃±2℃氮吹仪上浓缩至干或在低于50℃下减压蒸馏至干，残留物用1mL超纯水溶解，即为试样溶液；
B、游离氨基酸试样制备：准确称取混合均匀的样品约2.5g，精确至0.0001g放入100mL锥形瓶中，加入约25mL45℃～50℃温水溶解，降至室温后用盐酸溶液调节样品溶液的pH值至1.7±0.1，放置约1min，再用氢氧化钠溶液调节样品溶液的pH值至4.5±0.1，超声振荡约10min，用水转移并定容至50mL容量瓶中混匀，滤纸过滤后经0.22μm滤膜过滤，滤液即为试样溶液；
（2）曲线的制作
A、氨基酸标准曲线制作：将标准工作液衍生液注入到超高效液相色谱仪或高校液相色谱仪中，得到氨基酸标准工作液的峰面积，以标准工作液的峰面积为纵坐标，以标准工作液浓度μmol/mL为横坐标绘制标准曲线，该曲线用于计算各氨基酸浓度和含量，其中含量以每100克蛋白质中氨基酸所含克数表示；
B、样品定量计算的双曲线制作：以配制的不同酪蛋白含量为纵坐标，...

【专利技术属性】
技术研发人员：周红，张丽宏，张秋梅，卢雁，唐晓娜，于力涛，杨金宝，鄂来明，
申请(专利权)人：黑龙江省绿色食品科学研究院，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23