一种新的基于重叠延伸PCR的载体构建方法以及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种新的基于重叠延伸PCR的载体构建方法：(1)根据目的基因和目的载体的序列设计第一轮PCR扩增引物对，上游引物5’端部分为目的载体上目的基因插入位置之前的20～35bp同源臂序列，3’端部分为目的基因扩增特异引物；下游引物5’端部分为目的载体上目的基因插入位置之后的20～35bp同源臂序列，3’端部分为目的基因扩增特异引物；(2)用第一轮PCR扩增引物扩增目的基因；(3)回收第一轮PCR产物，以回收产物作为引物，以环形的目的质粒载体作为模板，进行第二轮PCR反应；(4)消化第二轮PCR产物；(5)取消化后的PCR产物转化大肠杆菌，摇菌提取质粒，鉴定得到含有目的基因的正确重组质粒。

【技术实现步骤摘要】
一种新的基于重叠延伸PCR的载体构建方法以及试剂盒
本专利技术属于生物
，涉及一种新的载体构建方法，特别是涉及一种新的基于重叠延伸PCR的载体构建方法以及试剂盒。
技术介绍
载体构建是目前分子生物学的常用技术，在基因工程中，人们常用质粒作为载体，将目的基因插入到质粒中，这样质粒就可以将基因分子运送到受体细胞中去。因此质粒可以用来保存基因或者表达基因产物用于功能性研究。因此载体构建是科学研究和基因工程产业中用到最广泛的一种技术。目前载体构建的主流方法有2种，一是酶切连接，利用载体上自带的多克隆酶切位点，选择合适的酶切位点组合，将基因定向插入到载体中；二是同源重组，利用T3/T5外切酶的活性，对末端带有目标载体同源臂序列的外源PCR产物和线性化的载体DNA双链进行3’/5’端外切，形成了相同的粘性末端，通过连接反应，将外源DNA插入到质粒中去。酶切连接是传统的方法，目前DNA的限制性内切酶发展得非常成熟，酶切位点数目多，内切酶活性和特异性高。酶切连接法具有标准化的操作流程，因此成为载体构建的主流选择。而同源重组法，是近些年来开发的新技术，它利用了核酸外切酶来制造粘性末端的特点，基因和载体产生匹配的粘性末端，并连接成环形质粒，因此它的本质还是粘性末端的连接反应，但是由于它能够产生更长的粘性末端一般具有更好的连接效率，得到的克隆数会大大提高，另外它能够避免基因内部存在限制性酶切位点而不能选择使用的情况，所以它降低了载体构建对酶切位点的挑剔，因而也受到了越来越多的人关注。例如适用于多片段连接的gibsonassembly也是同源重组的范畴。尽管酶切连接和同源重组这两种技术已经使用非常普遍了，但是它们还是存在自身的缺点。酶切连接存在酶切位点选择的局限性，比如有些基因内部含有较多的限制性酶切位点，限制了双酶切的酶切位点组合的选择；另外不同基因构建经常选择不同的酶切位点组合，这样不利于多个基因载体构建的同时进行。同源重组基本不存在酶切位点的限制，并且也能够批量生产，但是它的问题是需要使用线性化的载体片段进行构建，不管是通过酶切还是PCR获得，增加了额外操作的步骤。因此我们专利技术的重叠延伸PCR载体构建法，它可以实现无缝连接，不存在酶切位点的制约，同时以环形质粒作为模板，通过PCR的方法直接将基因片段整合到载体的任何部位或者删除原有载体的任何一段序列，操作方便、高效，具有重要的应用价值。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术的第一方面，提供一种新的基于重叠延伸PCR的载体构建方法，可以将目的基因插入到目的载体的任何位置，并且可以是基因插入、替换原有部分，适用性非常广泛，使用非常方便、高效，能够实现无缝连接和批量操作。一种新的基于重叠延伸PCR的载体构建方法，包括如下步骤：(1)根据目的基因和目的载体的序列，设计第一轮PCR扩增引物对，引物设计时带上目的载体同源臂序列，上游引物包括两部分：引物5’端部分为目的载体上目的基因插入位置之前(这里插入位置前、后是指目的载体上按5’到3’方向上，靠近5’端的为“之前”，靠近3’端的为“之后”)的20～35bp同源臂序列，引物3’端部分为目的基因扩增特异上游引物；下游引物也包括两部分：引物5’端部分为目的载体上目的基因插入位置之后的20～35bp同源臂的反向互补序列，引物3’端部分为目的基因扩增特异下游引物；优选所述同源臂序列为23～29bp；(2)用第一轮PCR扩增引物对进行常规PCR反应扩增目的基因，扩增产物为带有同源臂的目的基因片段；(3)回收第一轮PCR产物，以回收产物作为引物，以环形的目的质粒载体作为模板，进行第二轮PCR反应，得到包含该基因片段加目的载体序列的PCR产物，为带有缺口的环形质粒；(4)消化第二轮PCR产物，去除反应体系中的模板质粒；(5)取消化后的第二轮PCR产物转化大肠杆菌，得到单克隆菌落，摇菌提取质粒，鉴定得到含有目的基因的正确重组质粒。所述第一轮PCR的反应体系包括：DNA聚合酶、第一轮PCR扩增引物对、含有目的基因的扩增模板、ddH2O；优选所述DNA聚合酶为MaxDNAPolymerase。所述第一轮PCR的反应程序为：94℃预变性2min；98℃变性10sec，退火温度为Tm-[5～10]℃、时间为10sec，72℃延伸、持续时间按照10s/kb设定，35个循环；最后72℃延伸。所述第二轮PCR的反应体系包括：DNA聚合酶、第一轮PCR回收产物、MgSO4、目的载体模板、ddH2O；优选第二轮PCR的反应体系包括：KODDNAPolymerase及缓冲液、dNTPs、第一轮PCR回收产物、MgSO4、目的载体模板、ddH2O。所述第二轮PCR的反应程序为：94℃预变性2min；98℃变性10sec，55℃退火20sec，68℃延伸、持续时间按照1min/kb设定，12～15个循环；最后68℃延伸。在上述技术方案中，所述目的基因为LGI1基因，所述目的载体为pEGFP-N1，所述第一轮PCR扩增引物序列如SEQIDNO.1和2所示；或者，所述目的基因为Caspr1基因，所述目的载体为pEGFP-N1，所述第一轮PCR扩增引物序列如SEQIDNO.4和5所示；或者，所述目的基因为LGI1基因，所述目的载体为pEGFP-N1-Caspr1，所述第一轮PCR扩增引物序列如SEQIDNO.7和8所示；优选地，所述步骤(4)采用Dpn1消化第二轮PCR产物；优选所述目的基因不超过4000bp，所述目的载体不超过10kbp。本专利技术的第二方面提供一种新的基于重叠延伸PCR的载体构建试剂盒，包括PCR扩增特异引物对，所述引物对的上游引物结构为：5’-目的载体插入位置之前的20～35bp同源臂序列+目的基因正向扩增序列-3’，下游引物结构为：5’-目的载体插入位置之后的20～35bp同源臂反向互补序列+目的基因反向扩增序列-3’。所述试剂盒还包括DNA聚合酶、目的载体模板。所述试剂盒还包括含有目的基因的扩增模板、MgSO4、Dpn1、DNA聚合酶的缓冲液、大肠杆菌感受态细胞、dNTPs；优选所述DNA聚合酶包括MaxDNAPolymerase和KODDNAPolymerase。本专利技术方法流程和原理如图1所示：引物设计时带上20-35bp的目的载体同源臂序列(上游引物携带目的载体插入位置之前的20-35bp同源臂序列，下游引物携带目的载体插入位置之后的20-35bp同源臂序列)，第一轮进行常规PCR反应，得到带有同源臂的基因片段，然后切胶/过柱回收该PCR产物，以第一轮PCR的产物作为引物，进行第二轮PCR反应，以环形的质粒作为模板，得到包含该基因片段加载体序列的PCR产物，退火形成带有缺口的环形质粒，消化掉反应体系中的模板质粒，然后将带有缺口的环形质粒转化大肠杆菌感受态细胞，在细菌体内进行缺口修复，得到单克隆菌落，摇菌提取质粒，经测序验证，得到含有目的基因的正确重组质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新的基于重叠延伸PCR的载体构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)根据目的基因和目的载体的序列，设计第一轮PCR扩增引物对，引物设计时带上目的载体同源臂序列，上游引物包括两部分：引物5’端部分为目的载体上目的基因插入位置之前的20～35bp同源臂序列，引物3’端部分为目的基因扩增特异引物；下游引物也包括两部分：引物5’端部分为目的载体上目的基因插入位置之后的20～35bp同源臂的反向互补序列，引物3’端部分为目的基因扩增特异下游引物；/n优选所述同源臂序列为23～29bp；/n(2)用第一轮PCR扩增引物对进行常规PCR反应扩增目的基因，扩增产物为带有同源臂的目的基因片段；/n(3)回收第一轮PCR产物，以回收产物作为引物，以环形的目的质粒载体作为模板，进行第二轮PCR反应，得到包含该基因片段加目的载体序列的PCR产物，为带有缺口的环形质粒；/n(4)消化第二轮PCR产物，去除反应体系中的模板质粒；/n(5)取消化后的第二轮PCR产物转化大肠杆菌，得到单克隆菌落，摇菌提取质粒，鉴定得到含有目的基因的正确重组质粒。/n

【技术特征摘要】
1.一种新的基于重叠延伸PCR的载体构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)根据目的基因和目的载体的序列，设计第一轮PCR扩增引物对，引物设计时带上目的载体同源臂序列，上游引物包括两部分：引物5’端部分为目的载体上目的基因插入位置之前的20～35bp同源臂序列，引物3’端部分为目的基因扩增特异引物；下游引物也包括两部分：引物5’端部分为目的载体上目的基因插入位置之后的20～35bp同源臂的反向互补序列，引物3’端部分为目的基因扩增特异下游引物；
优选所述同源臂序列为23～29bp；
(2)用第一轮PCR扩增引物对进行常规PCR反应扩增目的基因，扩增产物为带有同源臂的目的基因片段；
(3)回收第一轮PCR产物，以回收产物作为引物，以环形的目的质粒载体作为模板，进行第二轮PCR反应，得到包含该基因片段加目的载体序列的PCR产物，为带有缺口的环形质粒；
(4)消化第二轮PCR产物，去除反应体系中的模板质粒；
(5)取消化后的第二轮PCR产物转化大肠杆菌，得到单克隆菌落，摇菌提取质粒，鉴定得到含有目的基因的正确重组质粒。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一轮PCR的反应体系包括：DNA聚合酶、第一轮PCR扩增引物对、含有目的基因的扩增模板、ddH2O；
优选所述DNA聚合酶为MaxDNAPolymerase。


3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述第一轮PCR的反应程序为：94℃预变性2min；98℃变性10sec，退火温度为Tm-[5～10]℃、时间为10sec，72℃延伸、持续时间按照10s/kb设定，35个循环；最后72℃延伸。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第二轮PCR的反应体系包括：DNA聚合酶、第一轮PCR回收产物、MgSO4、目的载体模板、ddH2O；
优选第二轮PCR的反应体系包括：KODDNAPolymeras...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘亮，袁玲，刘莎，
申请(专利权)人：北京华青创想教育科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11